Bna05菌株抗霉成分的分離鑒定及對稻谷防霉效果研究.pdf

1、霉變是導致糧食貯藏期品質下降和重量損失的主要原因。稻谷因其生長環(huán)境高溫高濕的特點，儲藏期內極易發(fā)霉變質和積累霉菌毒素。傳統(tǒng)化學藥物的使用對環(huán)境造成的負面影響和病原菌逐年增強的抗藥性問題，使得開發(fā)生物源的新型稻谷防霉劑成為農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然需求。本論文以前期研究中分離到的具有高抗霉活性的納豆芽孢桿菌Bna05菌株為發(fā)酵菌種，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化、抗霉活性物質分離鑒定、抗霉作用機制研究和稻谷防霉試驗研究，旨在探明Bna05菌株抗霉活性物質主要

2、成分和功能，為開發(fā)廣譜、安全、高效的稻谷防霉劑提供理論依據。
　　通過單因素實驗及響應曲面設計對Bna05菌株產抗霉活性物質的液體發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，確定了該菌株產生抗霉活性物質的適宜條件為:溫度30℃、培養(yǎng)時間37 h、初始pH值6.6。適宜的培養(yǎng)基配方為:大豆蛋白胨（或胰蛋白胨、蛋白胨）1g、葡萄糖2g、牛肉膏0.3g、Na2HPO40.15g、KH2PO40.1g、酵母浸出粉0.3 g、谷氨酸0.06 g、天冬氨酸0.06

3、g、水100 mL。優(yōu)化后所得Bna05發(fā)酵上清液的抑霉率為87.02％，比發(fā)酵工藝優(yōu)化前提高了65.69％。
　　利用抗菌脂肽合成酶類基因片段的特異性引物對Bna05菌株的基因組DNA進行擴增、測序和Blast比對，結果表明:Bna05菌株含有sfp和srfAA基因，未檢測到ituC、ituD、fenD、fenACE、bymB、bymC基因的存在。Bna05菌株發(fā)酵上清液的固相萃取物經RP-HPLC分離后，得到三組抗霉活性物質:

4、F2、 F3和F4，通過微孔板比色法測得F2、F3和F4對黑曲霉的MIC50值分別為50、200和100μg/mL。質譜鑒定的結果，發(fā)現F3中存在兩種V7-surfactin異構體，樣品F4中存在三種I/L7-surfactin同系物。對F2進行LC/MS/MS分析的結果發(fā)現F2中存在與Subtilisin、Fibrinolytic enzyme和Serine alkaline protease結構類似的小分子蛋白類物質，這些小分子抗菌

5、蛋白的存在，應該是樣品F2表現出較強抗霉活性的主要原因。
　　通過對受試霉菌進行PI染色觀察、核酸及蛋白泄露情況測定、光學和掃描電鏡觀察的結果表明:經F2處理后的黑曲霉孢子大部分受到損傷，但未出現細胞裂解;F3、F4能導致部分霉菌孢子破裂，但對未破裂的孢子損傷較小;F2、F3和F4均能引起黑曲霉核酸和蛋白泄露，泄露量在處理的前3h呈快速增長趨勢。光學顯微鏡觀察的結果表明，F2、F3、F4均能延遲黑曲霉孢子的萌發(fā)和抑制菌絲生長。F2

6、存在條件下的黑曲霉生長過程中易出現大量結團，F3、F4存在條件下的黑曲霉菌絲附近出現疑似胞內物質泄露物形成的泡狀物，F4所導致這種泄露現象比F3更明顯。掃描電鏡觀察的結果顯示，經F2、F3、F4處理后的黑曲霉菌絲均呈現萎蔫、局部凹陷、表面粗糙、生長受抑等特征;而對照組菌絲則生長旺盛、菌絲飽滿、表面光滑。初步的協(xié)同抗霉試驗結果表明，V7-surfactin、I/L7-surfactin均能與F2發(fā)生抗霉協(xié)同作用，兩類Surfactin之間

7、無抗霉協(xié)同作用。
　　對Bna05菌株發(fā)酵上清液固相萃取物SPEL進行抗霉菌譜測定和穩(wěn)定性分析的結果表明，SPEL對黑曲霉、黃曲霉、根霉、青霉和煙曲霉均有較好的抑制效果。SPEL對高溫和酸堿均具有一定的耐受性，但應避免80℃以上的高溫、強酸、強堿及與Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+接觸或混合使用。稻谷防霉試驗研究結果表明，每g稻谷中加入300μg SPEL時，可將稻谷中的霉菌數由對照組中的嚴重危害級降低到臨界級，脂肪酸度所對