Bna05菌株抗霉成分的分離鑒定及對(duì)稻谷防霉效果研究.pdf

1、霉變是導(dǎo)致糧食貯藏期品質(zhì)下降和重量損失的主要原因。稻谷因其生長(zhǎng)環(huán)境高溫高濕的特點(diǎn)，儲(chǔ)藏期內(nèi)極易發(fā)霉變質(zhì)和積累霉菌毒素。傳統(tǒng)化學(xué)藥物的使用對(duì)環(huán)境造成的負(fù)面影響和病原菌逐年增強(qiáng)的抗藥性問(wèn)題，使得開(kāi)發(fā)生物源的新型稻谷防霉劑成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然需求。本論文以前期研究中分離到的具有高抗霉活性的納豆芽孢桿菌Bna05菌株為發(fā)酵菌種，通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化、抗霉活性物質(zhì)分離鑒定、抗霉作用機(jī)制研究和稻谷防霉試驗(yàn)研究，旨在探明Bna05菌株抗霉活性物質(zhì)主要

2、成分和功能，為開(kāi)發(fā)廣譜、安全、高效的稻谷防霉劑提供理論依據(jù)。
　　通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)對(duì)Bna05菌株產(chǎn)抗霉活性物質(zhì)的液體發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了該菌株產(chǎn)生抗霉活性物質(zhì)的適宜條件為:溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間37 h、初始pH值6.6。適宜的培養(yǎng)基配方為:大豆蛋白胨（或胰蛋白胨、蛋白胨）1g、葡萄糖2g、牛肉膏0.3g、Na2HPO40.15g、KH2PO40.1g、酵母浸出粉0.3 g、谷氨酸0.06 g、天冬氨酸0.06

3、g、水100 mL。優(yōu)化后所得Bna05發(fā)酵上清液的抑霉率為87.02％，比發(fā)酵工藝優(yōu)化前提高了65.69％。
　　利用抗菌脂肽合成酶類基因片段的特異性引物對(duì)Bna05菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序和Blast比對(duì)，結(jié)果表明:Bna05菌株含有sfp和srfAA基因，未檢測(cè)到ituC、ituD、fenD、fenACE、bymB、bymC基因的存在。Bna05菌株發(fā)酵上清液的固相萃取物經(jīng)RP-HPLC分離后，得到三組抗霉活性物質(zhì):

4、F2、 F3和F4，通過(guò)微孔板比色法測(cè)得F2、F3和F4對(duì)黑曲霉的MIC50值分別為50、200和100μg/mL。質(zhì)譜鑒定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)F3中存在兩種V7-surfactin異構(gòu)體，樣品F4中存在三種I/L7-surfactin同系物。對(duì)F2進(jìn)行LC/MS/MS分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)F2中存在與Subtilisin、Fibrinolytic enzyme和Serine alkaline protease結(jié)構(gòu)類似的小分子蛋白類物質(zhì)，這些小分子抗菌

5、蛋白的存在，應(yīng)該是樣品F2表現(xiàn)出較強(qiáng)抗霉活性的主要原因。
　　通過(guò)對(duì)受試霉菌進(jìn)行PI染色觀察、核酸及蛋白泄露情況測(cè)定、光學(xué)和掃描電鏡觀察的結(jié)果表明:經(jīng)F2處理后的黑曲霉孢子大部分受到損傷，但未出現(xiàn)細(xì)胞裂解;F3、F4能導(dǎo)致部分霉菌孢子破裂，但對(duì)未破裂的孢子損傷較小;F2、F3和F4均能引起黑曲霉核酸和蛋白泄露，泄露量在處理的前3h呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。光學(xué)顯微鏡觀察的結(jié)果表明，F(xiàn)2、F3、F4均能延遲黑曲霉孢子的萌發(fā)和抑制菌絲生長(zhǎng)。F2

6、存在條件下的黑曲霉生長(zhǎng)過(guò)程中易出現(xiàn)大量結(jié)團(tuán)，F(xiàn)3、F4存在條件下的黑曲霉菌絲附近出現(xiàn)疑似胞內(nèi)物質(zhì)泄露物形成的泡狀物，F(xiàn)4所導(dǎo)致這種泄露現(xiàn)象比F3更明顯。掃描電鏡觀察的結(jié)果顯示，經(jīng)F2、F3、F4處理后的黑曲霉菌絲均呈現(xiàn)萎蔫、局部凹陷、表面粗糙、生長(zhǎng)受抑等特征;而對(duì)照組菌絲則生長(zhǎng)旺盛、菌絲飽滿、表面光滑。初步的協(xié)同抗霉試驗(yàn)結(jié)果表明，V7-surfactin、I/L7-surfactin均能與F2發(fā)生抗霉協(xié)同作用，兩類Surfactin之間

7、無(wú)抗霉協(xié)同作用。
　　對(duì)Bna05菌株發(fā)酵上清液固相萃取物SPEL進(jìn)行抗霉菌譜測(cè)定和穩(wěn)定性分析的結(jié)果表明，SPEL對(duì)黑曲霉、黃曲霉、根霉、青霉和煙曲霉均有較好的抑制效果。SPEL對(duì)高溫和酸堿均具有一定的耐受性，但應(yīng)避免80℃以上的高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及與Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+接觸或混合使用。稻谷防霉試驗(yàn)研究結(jié)果表明，每g稻谷中加入300μg SPEL時(shí)，可將稻谷中的霉菌數(shù)由對(duì)照組中的嚴(yán)重危害級(jí)降低到臨界級(jí)，脂肪酸度所對(duì)