西青果抗炎活性成分的分離鑒定及體內外抗炎作用研究.pdf

1、目的：西青果為訶子屬植物訶子Terminalia chebula Retz未木質化的幼果經水燙、曬干后的干燥幼果，具有清熱生津，解毒的作用，臨床上用于陰虛白喉。目前，對西青果的化學成分及相應生物學效應研究較少，但對其成熟果實訶子的研究較多，研究文獻顯示訶子果實所含化學成分主要為酚酸類化學成分，這類成分具有抗氧化、抗菌、抗炎等多種生物活性。有文獻研究證實，訶子含水乙醇提取物能對抗巨噬細胞源性促炎癥細胞因子的表達，具有抗炎活性。體外細胞試驗

2、文獻也證實，訶子中主要化學成分之一訶黎勒酸具有同時抑制炎癥發(fā)生過程中的兩種關鍵性酶:5-脂氧合酶(5-LOX)和2-環(huán)氧合酶(COX-2)活性的能力，可起到減輕炎癥反應的作用。
　　本文探討了西青果抗炎活性成分的提取、分離和鑒定，并在細胞水平和整體動物水平對其主要成分柯子寧(Chebulanin)的抗炎作用進行研究，為闡明西青果藥效物質及作用機理奠定了基礎。
　　方法和結果：
　　第一部分 西青果抗炎活性成分的分離及結

3、構鑒定
　　方法：
　　1.西青果總酚酸類化合物的提取
　　西青果藥材粗粉經70％丙酮浸漬提取3次;提取液減壓濃縮（控制溫度不高于50℃）至無丙酮味。濃縮液適量，先用苯萃取3次，下層藥液用乙酸乙酯多次萃取，合并乙酸乙酯，減壓濃縮（控制溫度不高于50℃），得黃褐色固體。
　　2.西青果總酚酸類成分的HPLC檢測
　　色譜柱為Ultimate LP-C18(250mm×4.6mm，5μm);流動相為甲醇（流動相

4、A）和0.6％磷酸（流動相B），在流速1.2mL/min，檢測波長278nm，柱溫40℃的條件下進行梯度洗脫。
　　3.西青果酚酸類化合物的分離
　　4.單體化合物的結構鑒定
　　結果：
　　1.總酚酸類提取物色譜圖
　　在西青果總酚酸類提取物色譜圖中，用對照品進行對照，確定了部分色譜峰的歸屬，依次為沒食子酸(tR7.45min)、柯里拉京(tR20.59min)、柯子寧(tR21.53min)、訶黎勒酸(

5、tR29.76min)、訶子酸(tR37.25min)。
　　2.大孔吸附樹脂柱分離結果
　　西青果總酚酸類提取物經大孔吸附樹脂柱分離，合并洗脫液，得到了化合物Ⅰ（白色針狀結晶）、化合物Ⅱ（白色粉末狀固體）、化合物Ⅲ（類白色無定形粉末）和化合物Ⅳ（白色片狀結晶）。
　　3.單體化合物的結構鑒定結果
　　第二部分 西青果提取物柯子寧抑制LPS對單核/巨噬細胞炎癥信號通路及細胞因子的作用研究
　　方法：

6、　　1.不同濃度柯子寧對RAW264.7細胞生長的影響
　　配制系列濃度的柯子寧溶液(1000μM，500μM，200μM，100μM，50μM，10μM，1μM)以及陽性對照藥地塞米松溶液(10μM，5μM，1μM，0.5μM，0.1μM，0.01μM，0.001μM)。細胞培養(yǎng)24小時后，換成以上含藥物培養(yǎng)基于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時。按照CCK8說明書測定450nm處的吸光度，計算抑制率。陰性對照組為PBS，

7、每個濃度設置3個復孔。抑制率(％)=(1-T/C)×100％，其中T表示實驗孔的吸光度，C表示對照孔的吸光度。
　　2.Real-time PCR法測定柯子寧對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子mRNA水平的影響
　　5×105個RAW264.7細胞接種于12孔板，過夜培養(yǎng)12小時后，每孔加入不同濃度的柯子寧（終濃度分別為100μM，50μM，10gM），0.5μM的地塞米松作為陽性對照，PBS作為陰性對照，于37℃，

8、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時。以100ng/mL的LPS刺激細胞20小時后，收集細胞提取mRNA，行RT-PCR檢測細胞炎癥因子TNF-α、COX-2的mRNA表達情況。每個樣本均設三個復孔。
　　3.ELISA法測定柯子寧對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子分泌的影響
　　4.Western Blot法檢測柯子寧對LPS誘導的RAW264.7細胞NF-κB信號通路磷酸化水平的影響
　　結果：
　　1.柯子

9、寧對RAW264.7細胞體外增殖的影響
　　柯子寧在100μM以下，地塞米松在0.5μM以下時，抑制率小于10％，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)沒有明顯變化，與空白對照組相比無顯著性差異(p＜0.05)。因此，最后確定柯子寧使用100μM，地塞米松使用0.5μM，作為后續(xù)實驗的最大藥物濃度。
　　2.柯子寧對RAW264.7細胞炎癥因子mRNA表達水平的影響
　　0.5μM地塞米松可以顯著性降低TNF-a和COX-2 mRNA

10、的水平，可以作為陽性對照。100μM、50μM以及10μM的柯子寧均能夠顯著降低LPS誘導的炎癥因子TNF-a的mRNA水平(P＜0.01)，且呈比較明顯的濃度依賴效應。對于COX-2 mRNA水平變化，有著相同的趨勢，即100μM、50μM和10μM的柯子寧預處理細胞，能夠以一種濃度依賴性的方式顯著降低COX-2 mRNA水平(P＜0.01)。
　　第三部分 西青果提取物柯子寧治療關節(jié)炎模型小鼠的藥效及機制研究
　　方法：

11、
　　1.膠原蛋白誘導性關節(jié)炎(CIA)動物模型的制備
　　DBA/1小鼠按Brand等報道的方法造模，經初次免疫誘導劑初次免疫、加強免疫誘導劑加強免疫，制備CIA動物模型。
　　2.柯子寧對膠原誘導關節(jié)炎小鼠的治療
　　將30只SPF級DBA/1雄性小鼠（6周，18±2g）隨機分為五組，分別為對照組，模型組(CIA)，低劑量組（柯子寧，40mg/kg）、中劑量組（柯子寧，80mg/kg）和高劑量組（柯子寧，16

12、0mg/kg）;對照組和模型組灌胃給藥，模型組給予低、中、高三個劑量的柯子寧溶液（柯子寧溶解于1％羧甲基纖維素）;從初次免疫第39天（全部發(fā)病）開始給藥，每天一次，持續(xù)28天，給藥完成后繼續(xù)觀察2周，于初次免疫第80天斷頸處死小鼠，取雙側踝關節(jié)及足趾關節(jié)，用于Micro-CT掃描、病理切片。
　　3.體征觀察及關節(jié)炎程度評分
　　每天觀察各組小鼠飲食、活動及毛發(fā)改變，每周兩次采用文獻標準進行關節(jié)炎評分。
　　4.Mic

13、ro-CT影像學檢測
　　選取小鼠右后肢，使用Viva40 Micro CT儀對小鼠關節(jié)進行掃描并3D重建;采用SIPL軟件將骨組織與軟組織區(qū)分;同時，分析骨密度(BS)骨表面積/骨密度(BS/BV)和骨小梁厚度(Tb.Th)。
　　結果：
　　1.CIA小鼠臨床表現
　　經小鼠關節(jié)炎指數評價，初次免疫無任何小鼠發(fā)展為關節(jié)炎;加強免疫（第21天）后第二天即有小鼠開始出現關節(jié)炎癥，至初次免疫第35天左右，實驗組24

14、只小鼠全部發(fā)展為關節(jié)炎，造模率100％。
　　2.高中劑量柯子寧能有效緩解CIA誘導的關節(jié)炎癥
　　結果顯示，給藥28天以后，中劑量組和高劑量組與模型組比，能顯著降低關節(jié)炎指數，差異有統計學意義(p＜0.05)。但低劑量組與模型組比，效果不明顯。治療結束后觀察兩周，結果顯示，高劑量和中劑量組小鼠炎癥指數維持在5-6分水平，與模型組（11分）比有顯著差異(p＜0.05)。低劑量組小鼠炎癥仍比較嚴重（9-10分），癥狀未得到明顯

15、改善。
　　3.Micro-CT影像學檢測
　　三維重建圖中可以看出，柯子寧中劑量組和高劑量組治療后小鼠骨表面侵蝕程度得到顯著緩解和改善。相關參數值BV, BS/BV以及Tb.Th的結果顯示，發(fā)病早期即給予柯子寧治療的小鼠與正常小鼠相比，仍有一定的骨損失，但與模型組相比，體積明顯增加，骨小梁厚度也明顯增厚。
　　結論：
　　1.利用含水丙酮冷浸提取、低溫濃縮回收丙酮、乙酸乙酯萃取和低溫濃縮的方法得到酚酸提取物。利

16、用大孔吸附樹脂等分離方法，對西青果酚酸提取物進行分離、純化，得到酚酸類化合物單體，并對其進行結構鑒定。最終獲得四種單體:沒食子酸(Gallicacid)、柯子寧(Chebulanin)、訶黎勒酸(Chebulagic acid)和訶子酸(Chebulinic acid)。
　　2.RAW264.7細胞實驗顯示，柯子寧可顯著抑制LPS誘導的炎癥因子TNF-a mRNA水平，和TNF-a和IL-6蛋白表達水平;也可以顯著性抑制炎癥關鍵