蛹蟲草中生物活性成分的分離鑒定及抗HIV機(jī)制的研究.pdf

1、自1981年6月首例由HIV引起的獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS）被美國疾病控制中心確認(rèn)以來，AIDS嚴(yán)重威脅著人類的生存與健康。本文以食用菇類為研究對(duì)象，圍繞其中多效抗HIV-1活性組分的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性進(jìn)行研究。
　　 已有研究顯示氧化應(yīng)激與艾滋病間存在著密切的關(guān)系。因此本研究首先以抑制紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)作為抗氧化活性篩選的指標(biāo)，測(cè)定了九種不同的食用菇類，從中篩選確定蛹蟲草為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并以其子實(shí)體為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行深入的

2、研究。蛹蟲草子實(shí)體經(jīng)水提醇沉后，上清液命名為L(zhǎng)，沉淀命名為C。利用大孔吸附樹脂從L中分離得到四個(gè)組分（L1，L2，L3和L4），其中L3抗氧化活性最強(qiáng)：進(jìn)一步通過高效液相色譜技術(shù)從L3中分離出三種抗氧化活性物質(zhì)--f1，f2和f3。對(duì)這三種物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，推斷其可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為：f1，腺苷（分子式為：C10H13N5O4）；f2，異黃酮（分子式為：C20H20O7）；f3，二甲基鳥苷（分子式為：C12H17 N5O5）；樣品C經(jīng)

3、DEAE-cellulose離子交換得到活性組分CD，再經(jīng)Sephadex-75凝膠分離得到一個(gè)大分子抗氧化活性組分--CDS1。初步推測(cè)CDS1可能為含有鞣質(zhì)、糖和蛋白質(zhì)的聚合物。體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，f1，f2和f3濃度為250μg/ml時(shí)，對(duì)紅細(xì)胞溶血的抑制率均大于90％。同時(shí)，樣品f1、f2、f3和CDS1作用于紅細(xì)胞，可以提高紅細(xì)胞中SOD酶的活性。
　　 抗HIV-1活性的研究從抑制HIV-1蛋白酶（PR）和H

4、IV-1逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）兩方面進(jìn)行。針對(duì)目前HIV-1 PR抑制劑篩選方法中存在的操作復(fù)雜，價(jià)格昂貴等問題，本文利用HIV-1 PR對(duì)其外源表達(dá)宿主具有毒性作用的原理，構(gòu)建了以大腸桿菌為宿主，pET28a為載體的HIV-1 PR抑制劑篩選體系。通過監(jiān)測(cè)大腸桿菌表達(dá)HIV-1蛋白酶時(shí)的生長(zhǎng)情況來評(píng)價(jià)樣品對(duì)HIV-1蛋白酶活性的抑制作用。該體系以大腸桿菌為宿主，使用酶標(biāo)儀采集數(shù)據(jù)不僅簡(jiǎn)化了操作流程，而且提高了安全性能，降低了實(shí)驗(yàn)成本。同時(shí)，

5、結(jié)合非放射性逆轉(zhuǎn)錄酶ELISA方法對(duì)蛹蟲草中抗氧化活性組分的抗HIV-1 PR和HIV-1 RT活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。測(cè)試結(jié)果表明：L，L3，f1和f2對(duì)HIV-1 PR均具有抑制作用，其中f1活性最高，濃度為70μg/ml時(shí)比L3增高了約31％；C，CD，CDS1對(duì)HIV-1 R工具有一定的抑制作用。
　　 在對(duì)HIV-1感染者的治療中，細(xì)胞免疫功能的恢復(fù)作為免疫重建的重要組成部分日益受到重視，而細(xì)胞因子又是衡量細(xì)胞免疫功能的主要指

6、標(biāo)。因此，本文研究了活性樣品L3和CD對(duì)小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響。首先，以腹腔注射的方式對(duì)小鼠分別給藥；接著采用SYBR Green為熒光染料的實(shí)時(shí)定量PCR方法，研究活性樣品對(duì)小鼠脾臟細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和IFN-γmRNA表達(dá)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥小鼠體內(nèi)IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ四種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平有顯著變化，其中活性樣品L3和CD對(duì)小鼠的IL-2