活性氧自由基參與介導(dǎo)表皮生長因子刺激的角膜上皮細(xì)胞生長和創(chuàng)傷修復(fù)的研究.pdf

1、氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)包括超氧化陰離子(O2)，羥自由基(·OH)，過氧化氫(H2O2)等。ROS通常被認(rèn)為是細(xì)胞呼吸鏈的毒性代謝產(chǎn)物，或病理損傷下由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，由于ROS為小分子物質(zhì)，亦可以由外界環(huán)境彌散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。ROS一般被認(rèn)為是對人體有害的。 既往的研究認(rèn)為ROS對角膜上皮有害，角膜上皮細(xì)胞在病理?xiàng)l件下由線粒體產(chǎn)生大量ROS，如紫外線照射、屈光手術(shù)創(chuàng)傷、眼前段化學(xué)傷等異常刺激及損

2、傷均可導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，造成細(xì)胞功能受損甚至死亡。在眼科其他領(lǐng)域的研究中，ROS被認(rèn)為是導(dǎo)致白內(nèi)障、黃斑變性等疾病發(fā)生的重要原因。目前尚未有關(guān)于ROS參與調(diào)控角膜上皮細(xì)胞生長以及與生長因子、細(xì)胞因子等有絲分裂相關(guān)信號通路間互作用的研究報道。本學(xué)位論文以人角膜上皮細(xì)胞株(humancornealepithelialcell，HCEcellline)及原代培養(yǎng)的兔角膜上皮細(xì)胞(rabbitcornealepithelialcell，RCE

3、cell)為研究模型，發(fā)現(xiàn)表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF)可以刺激角膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生一過性ROS，并且這種內(nèi)源性ROS參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、粘著、移行及創(chuàng)傷修復(fù)等生理功能。我們同時發(fā)現(xiàn)，短期、低濃度外源性H2O2刺激對角膜上皮細(xì)胞生長及創(chuàng)傷修復(fù)具有一定的促進(jìn)作用。 第一部分：內(nèi)源性ROS的發(fā)現(xiàn)及其對細(xì)胞增殖、粘著、移行以及創(chuàng)傷修復(fù)的影響 為探索EGF能否刺激角膜上皮細(xì)胞生成內(nèi)源性ROS，將HC

4、E及RCE細(xì)胞隔夜逐步脫血清處理后用ROS特異性熒光染料DCF—DA染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察EGF(5ng/ml)能否刺激角膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性ROS。添加抗氧化劑N—acetylcysteine(NAC，40mM)組作陰性對照，觀察細(xì)胞內(nèi)熒光生成變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGF能刺激HCE細(xì)胞在90分鐘內(nèi)產(chǎn)生一過性內(nèi)源性ROS；而抗氧化劑NAC對照組中EGF對內(nèi)源性ROS生成的作用被抑制，細(xì)胞在90分鐘的觀察時間內(nèi)無明顯熒光生成。為證明EGF

5、刺激所產(chǎn)生的熒光非轉(zhuǎn)染細(xì)胞株造成的偽像，進(jìn)一步采用原代培養(yǎng)的RCE細(xì)胞作為模型進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)，RCE細(xì)胞在5ng/mlEGF的作用下在60分鐘內(nèi)也可以產(chǎn)生一過性內(nèi)源性ROS，且抗氧化劑NAC及氧自由基清除劑mannitol預(yù)處理細(xì)胞可以抑制熒光強(qiáng)度的產(chǎn)生，我們在國際上首次證實(shí)了角膜上皮細(xì)胞在生長因子(EGF)的刺激下可以產(chǎn)生內(nèi)源性ROS。采用NADPH氧化酶、脂肪氧化酶(LOX)、線粒體等細(xì)胞內(nèi)ROS來源活性酶的特異性抑制劑

6、分別抑制酶活性，探索EGF刺激產(chǎn)生的內(nèi)源性ROS的來源。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶及LOX是表皮生長因子EGF刺激相關(guān)的內(nèi)源性ROS的生成來源，抑制這兩者活性后內(nèi)源性ROS生成明顯受到抑制，而線粒體抑制劑則對內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生無明顯影響。因此，在此部分實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)了EGF可以刺激角膜上皮細(xì)胞生成內(nèi)源性ROS，并確定了ROS來源為NADPH氧化酶及脂肪氧化酶。 采用BrdU檢測清除EGF刺激生成的內(nèi)源性ROS后細(xì)胞增殖的改變。與空白

7、對照組相比，5ng/mlEGF促進(jìn)RCE細(xì)胞DNA新合成數(shù)量增加28％，HCE細(xì)胞DNA新合成數(shù)量增加30％。而自由基清除劑mannitol(100mM)及抗氧化劑NAC(40mM)預(yù)先作用30分鐘清除內(nèi)源性ROS后，5ng/mlEGF對角膜細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用被抑制，以上結(jié)果證實(shí)角膜上皮細(xì)胞在EGF作用下產(chǎn)生的這種內(nèi)源性參與調(diào)控角膜上皮細(xì)胞的有絲分裂活動． Westernblot技術(shù)檢測抗氧化劑NAC清除內(nèi)源性ROS后對絲裂原活

8、化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號通道及其上游與細(xì)胞存活及增殖相關(guān)的AKT、MEK信號通道磷酸化及活化的影響。結(jié)果顯示：EGF刺激產(chǎn)生的ROS參與調(diào)節(jié)有絲分裂相關(guān)的MAPK等信號通道的活化，清除ROS可以抑制EGF下游信號通路的活化。 角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷修復(fù)主要包括細(xì)胞的增殖、粘著及移行三個主要步驟。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果已知內(nèi)源性ROS參與調(diào)控角膜上皮細(xì)胞增殖，接下來我們進(jìn)一步研究

9、ROS對細(xì)胞粘著及移行等方面的作用。傳代消化后的懸浮細(xì)胞接種于纖維粘連蛋白(作為細(xì)胞外基質(zhì))預(yù)處理的培養(yǎng)皿上，觀察并計數(shù)細(xì)胞接種后5小時內(nèi)抗氧化劑對細(xì)胞粘著發(fā)生的影響。重復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，清除內(nèi)源性ROS后EGF對細(xì)胞的促進(jìn)粘著作用被抑制，內(nèi)源性ROS參與EGF對細(xì)胞粘著的調(diào)控。 分別采用體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞模型及豬角膜器官培養(yǎng)模型觀察NAC預(yù)處理后或無NAC作用時EGF對創(chuàng)傷愈合的作用效果。HCE生長融合后人為制作一條水平創(chuàng)傷區(qū)

10、域，5ng/mlEGF作用組HCE細(xì)胞在16小時后完成創(chuàng)傷愈合，而NAC+EGF組細(xì)胞創(chuàng)傷愈合速度明顯減慢，16小時后未能完成修復(fù)。采用新鮮豬眼球制作角膜創(chuàng)傷器官培養(yǎng)模型，在中央?yún)^(qū)角膜制作直徑為9mm的上皮缺失區(qū)域，Richardson’s染料著色無上皮區(qū)，觀察48小時內(nèi)角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)情況。結(jié)果與HCE細(xì)胞株創(chuàng)傷模型相符，40mMNAC預(yù)處理組角膜由于清除了細(xì)胞內(nèi)ROS，上皮修復(fù)速度與單純EGF作用組相比明顯下降。以上結(jié)果證明，內(nèi)源性

11、ROS參與調(diào)節(jié)EGF對角膜上皮移行及創(chuàng)傷修復(fù)作用。 第二部分：低濃度外源性ROS(H2O2)對細(xì)胞增殖、粘著、移行以及創(chuàng)傷修復(fù)的影響 為研究外源性ROS是否具有與內(nèi)源性ROS相似的調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能的作用，本部分研究首先采用不同濃度的外源性ROS(過氧化氫，hydrogenperoxide，H2O2)刺激HCE細(xì)胞4小時，BrdU檢測DNA新合成數(shù)量發(fā)現(xiàn)10-30μM濃度范圍內(nèi)的H2O2能刺激角膜上皮細(xì)胞增殖，其中20μM

12、H2O2促角膜增殖作用最明顯，過低(＜10μM)或者過高(＞40μM)濃度的H2O2對細(xì)胞沒有促增殖作用，甚至抑制細(xì)胞增殖． 根據(jù)以上研究結(jié)果，我們選取20μMH2O2作用于鋪設(shè)纖維粘連蛋白培養(yǎng)皿中的懸浮細(xì)胞，觀察細(xì)胞接種后5小時內(nèi)抗氧化劑對細(xì)胞粘著發(fā)生的影響。實(shí)驗(yàn)證明，20μMH2O2作用細(xì)胞發(fā)生粘著的數(shù)量及速度均高于對照組及抗氧化劑組，低濃度H2O2具有與EGF類似的促細(xì)胞粘著能力。 在細(xì)胞移行的研究中，我們按第一部

13、分相同方法制作HCE細(xì)胞創(chuàng)傷模型，分別采用10μM、20μM、50μMH2O2作用于創(chuàng)傷細(xì)胞，只有20μMH2O2具有促進(jìn)細(xì)胞移行的作用。與對照組相比，10μM及50μMH2O2無明顯促細(xì)胞移行作用。平行組細(xì)胞創(chuàng)傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，抗氧化劑NAC抑制20μMH2O2組細(xì)胞的移行及創(chuàng)傷修復(fù)能力。 豬角膜創(chuàng)傷修復(fù)器官培養(yǎng)模型制作方法同前，分對照組、20μMH2O2作用組、NAC+H2O2作用三組實(shí)驗(yàn)。48小時培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，20μMH2O2

14、具有與EGF類似的促角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)作用，培養(yǎng)結(jié)束時角膜上皮修復(fù)幾乎全部完成，而40mM抗氧化劑NAC預(yù)處理30分鐘后，20μMH2O2對創(chuàng)傷修復(fù)的促進(jìn)作用被抑制。 基于以上的研究結(jié)果及分析討論，本學(xué)位申請人得出以下結(jié)論： 1．本研究在國際上首次發(fā)現(xiàn)表皮生長因子EGF能刺激角膜上皮細(xì)胞在短時間內(nèi)產(chǎn)生一過性內(nèi)源性ROS。 2．與EGF刺激相關(guān)的內(nèi)源性ROS主要來源于NADPH氧化酶及脂肪氧化酶，其產(chǎn)生與線粒體無明顯