胰島素樣生長(zhǎng)因子2及受體參與角膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和創(chuàng)傷修復(fù)的研究.pdf

1、角膜上皮細(xì)胞層是眼球抵御外界有害致病因素侵犯的第一道屏障，在受到創(chuàng)傷后可以快速修復(fù)愈合，當(dāng)愈合延遲時(shí)，會(huì)造成視力下降，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致失明。目前部分臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道角膜上皮本身存在一定的自我更新及修復(fù)能力，但角膜損傷后發(fā)揮主要作用的并非角膜上皮而是來(lái)自于角膜緣的細(xì)胞組織，該組織中含有角膜緣干細(xì)胞(LSC)，角膜緣干細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞增殖、分化及遷移來(lái)修復(fù)損傷的角膜組織。有報(bào)道稱(chēng)角膜緣干細(xì)胞缺失時(shí)角膜的修復(fù)功能會(huì)受到限制，且角膜修復(fù)功能還與角膜

2、結(jié)膜化、新生血管生成、慢性炎癥刺激及持續(xù)性的角膜上皮損害等因素有密切關(guān)系，在上述因素等持續(xù)存在，角膜最終不能夠修復(fù)時(shí)可產(chǎn)生嚴(yán)重的后果即失明，同時(shí)研究表明，我們可通過(guò)移植角膜緣組織及角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行角膜損傷的治療，這提示了角膜緣干細(xì)胞組織在創(chuàng)傷角膜修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在角膜損傷后，角膜緣干細(xì)胞即開(kāi)始增殖，并分化為過(guò)渡性細(xì)胞，這種細(xì)胞可遷移至損傷部位，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)角膜上皮細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)而促進(jìn)角膜損傷的修復(fù)。然而角膜上皮細(xì)胞與角膜緣干細(xì)胞組

3、織之間相互作用的分子通路及機(jī)制目前尚不清楚。
　　Jia等報(bào)道角膜機(jī)械或化學(xué)損傷后細(xì)胞中負(fù)責(zé)生長(zhǎng)及分化的因子基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、肝素樣生長(zhǎng)因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子β(FGF-β)等，這些因子均可由角膜上皮細(xì)胞生成，它們參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)。此外，胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2)也被證實(shí)能夠促使角蛋白細(xì)胞增殖，并使黏附連接蛋白N鈣黏附素

4、的生成增加，使細(xì)胞外基質(zhì)增加，從而促使角蛋白膠原的生成。胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)通路已被證實(shí)與細(xì)胞增殖及分化相關(guān)，在細(xì)胞及器官水平的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中起重要作用，IGF及以上所述其他細(xì)胞調(diào)節(jié)因子與角膜緣干細(xì)胞的增殖、分化及遷移的發(fā)生有關(guān)。
　　胰島素樣生長(zhǎng)因子家族(IGFs))是由兩種低分子多肽(IGF-1、IGF-2)、兩類(lèi)特異性受體及六種結(jié)合蛋白組成。人體內(nèi)許多組織都可以合成、分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子，但循環(huán)中的IGF則主要是由肝臟分泌的。胰

5、島素樣生長(zhǎng)因子家族的生物學(xué)功能是通過(guò)與特異性的靶細(xì)胞表面的胰島素樣生長(zhǎng)因子受體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。已發(fā)現(xiàn)有兩種結(jié)構(gòu)完全不同的IGF受體:IGF-1受體和IGF-2受體（即甘露糖6磷酸受體）分別又稱(chēng)1型受體和2型受體。正常情況下，IGF與其結(jié)合蛋白的親和力大于或近似等于與其受體的結(jié)合，加之高親和力受體低表達(dá)，使少量游離IGF與大量IGF/IGFBP復(fù)合物處于平衡狀態(tài)。IGFs的合成與分泌受血液中生長(zhǎng)激素水平的控制，循環(huán)中IGFs對(duì)生長(zhǎng)激素的分泌

6、具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，從而形成了一個(gè)生長(zhǎng)激素—胰島素樣生長(zhǎng)因子軸，其對(duì)機(jī)體組織的分化、增殖及物質(zhì)代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。以往研究表明，借助角膜上皮細(xì)胞表面的細(xì)胞表型標(biāo)記細(xì)胞角蛋白K3及K12或連接蛋白43可對(duì)角膜緣干細(xì)胞與角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，并且此類(lèi)因子與角膜緣干細(xì)胞的增殖及分化亦相關(guān)，且還有研究報(bào)道說(shuō)，角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液的上層部分可促使多種干細(xì)胞包括毛囊于細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞等，分化為攜帶角膜上皮細(xì)胞標(biāo)記K12的細(xì)胞，但相關(guān)

7、的分子機(jī)制仍不清楚。
　　目的：
　　角膜創(chuàng)傷修復(fù)的過(guò)程通常包括細(xì)胞的激活、增殖、分化，細(xì)胞因子的釋放，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與重塑等，都是由多種細(xì)胞因子在時(shí)間和空間上高度協(xié)調(diào)而完成的。明確角膜損傷修復(fù)過(guò)程中關(guān)鍵的調(diào)控分子及其作用機(jī)制，對(duì)于角膜損傷后減少瘢痕形成、促進(jìn)角膜愈合具有重要意義。本研究中我們利用小鼠角膜機(jī)械損傷模型對(duì)損傷后角膜上皮細(xì)胞與角膜緣干細(xì)胞間的相互作用分子機(jī)制進(jìn)行初步探究。
　　方法：
　　構(gòu)建小鼠單

8、側(cè)眼角膜機(jī)械損傷模型，對(duì)側(cè)角膜為對(duì)照組，不同時(shí)間點(diǎn)采集小鼠雙側(cè)角膜中央及角膜緣組織，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并基因檢測(cè)EGF、FGF-b、KGF、HGF、TGF-b1、IGF-1及IGF-2等細(xì)胞因子不同程度的反應(yīng)性改變，探究這些細(xì)胞因子對(duì)角膜緣干細(xì)胞分化及成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，并探討mTOR/STAT3信號(hào)通路在IGF-2調(diào)控角膜上皮細(xì)胞增殖分化過(guò)程中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.角膜上皮損傷后，小鼠眨眼加劇，有畏光的現(xiàn)象，角膜上有不

9、規(guī)則的斑塊狀結(jié)構(gòu);對(duì)損傷角膜組織行蘇木精-伊紅(HE)染色后顯示，針尖破壞角膜上皮層，而基質(zhì)層未受損，提示我們所采用的角膜機(jī)械損傷模型方法可行性良好。
　　2.中央角膜損傷后（0、3、6、12及24h）采集受損側(cè)小鼠角膜組織，實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的基因表達(dá)，損傷后3h及6h EGF、FGF-b、KGF、HGF、TGF-b1、IGF-1及IGF-2的基因表達(dá)水平升高，IGF-2因子的水平損傷后3h最高，并且顯著高于其他各種檢測(cè)

10、的細(xì)胞因子(p＜0.05)。
　　3.角膜損傷后角膜緣干細(xì)胞組織較角膜上皮細(xì)胞中兩種受體的基因表達(dá)水平顯著增加，3h后其表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4.IGF-2對(duì)角膜上皮細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，IGF-2干預(yù)組的增殖能力與對(duì)照組比較有明顯的區(qū)別。從24h開(kāi)始，IGF-2干預(yù)組的角膜上皮細(xì)胞遷移能力明顯高于對(duì)照組，48h更為明顯。通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)IGF-2組較對(duì)照組有更

11、強(qiáng)的粘附率。
　　5.胰島素樣生長(zhǎng)因子2（IGF-2）在角膜損傷后迅速大量表達(dá)，同時(shí)促使角膜緣細(xì)胞IGF2受體的表達(dá)增加并誘導(dǎo)角膜緣干細(xì)胞分化為帶有K12標(biāo)記的角膜上皮細(xì)胞。
　　6.免疫熒光染色分析顯示受損角膜組織細(xì)胞中α平滑肌肌動(dòng)蛋白水平顯著增加，提示可能存在成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
　　7.檢測(cè)磷酸化mTOR與磷酸化STAT3蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)p-mTOR與p-STAT3蛋白的表達(dá)均隨IGF-2濃度的增

12、加而增多。
　　8.使用IGF-2后，檢測(cè)EGF、FGF-b、KGF、HGF及TGF-b1等細(xì)胞因子損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)這幾個(gè)細(xì)胞因子在受到IGF-2刺激后，其蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組有顯著的升高，但當(dāng)同時(shí)再給予mTOR/STAT3信號(hào)通路抑制劑RAPA50μ mol/L后，發(fā)現(xiàn)上述幾個(gè)細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)被明顯抑制。
　　結(jié)論：
　　1.小鼠單側(cè)眼角膜機(jī)械損傷模型具有可重復(fù)性，角膜上皮能完全修復(fù)，模型制作成功，可

13、用于對(duì)角膜上皮損傷修復(fù)過(guò)程的研究。
　　2.角膜機(jī)械損傷后角膜上皮中IGF-2因子表達(dá)明顯上調(diào)，角膜緣組織中IGF-2受體表達(dá)增加，其共同作用促使角膜緣干細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同時(shí)在成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中起一定的作用，對(duì)角膜損傷修復(fù)有促進(jìn)作用。
　　3.在體外培養(yǎng)狀態(tài)下，特異性的阻斷mTOR/STAT3信號(hào)通路可以阻斷IGF-2對(duì)角膜上皮細(xì)胞的修復(fù)作用，IGF-2對(duì)角膜上皮細(xì)胞修復(fù)的這種效應(yīng)可能是通過(guò)激活mTOR