表皮生長(zhǎng)因子(EGF)基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 造成皮膚組織缺損后創(chuàng)面難以愈合的主要原因包括修復(fù)細(xì)胞缺乏和促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的各種生物活性因子的減少。如何在無(wú)足夠自體皮膚進(jìn)行移植等限制下，及時(shí)有效的修復(fù)難愈創(chuàng)面以盡可能達(dá)到恢復(fù)皮膚正常功能的愈合，是目前創(chuàng)面臨床治療的難點(diǎn)。因此本研究擬通過(guò)AAV介導(dǎo)EGF基因修飾骨髓MSCs，探討其對(duì)于促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的可能性，為皮膚組織工程種子細(xì)胞的來(lái)源及轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合提供一定的理論基礎(chǔ)及實(shí)踐依據(jù)。
　　 方法與結(jié)果：

2、
　　 1．構(gòu)建攜帶EGF基因的重組腺相關(guān)病毒載體
　　 通過(guò)RT-PCR從胎盤(pán)組織中擴(kuò)增出175bp大小的EGF基因，將其克隆入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。提取此重組質(zhì)粒DNA并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalⅠ酶切，獲得兩端分別帶有EcoRI和SalⅠ不同酶切位點(diǎn)的EGF基因片段，最終將其克隆入pAAV-IRES-hrGFP質(zhì)粒中，通過(guò)酶切和測(cè)序鑒定，證明成功構(gòu)建了pAAV-EGF-GFP質(zhì)粒。
　　

3、 2．AAV-EGF病毒的包裝、純化與檢測(cè)
　　 將pAAV-EGF-GFP、pAAV-RC、pHelper3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝含有EGF基因的AAV-EGF病毒載體；通過(guò)“氯仿處理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提”法純化AAV-EGF；用SDS-PAGE膠電泳檢測(cè)AAV的純度，以點(diǎn)雜交檢測(cè)AAV的滴度。最終證明獲得高純度高滴度的AAV-EGF病毒。
　　 3．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　

4、采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法體外培養(yǎng)獲取小鼠骨髓MSCs，并誘導(dǎo)MSCs向成骨、成軟骨和成脂肪三個(gè)方向分化，分別采用Von Kossa法、阿爾新藍(lán)麗春紅染色和油紅0染色方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明通過(guò)體外原代和傳代培養(yǎng)獲得的純化的小鼠MSCs具有向多個(gè)方向分化的能力，我們所培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 4.AAV-EGF轉(zhuǎn)染MSCs細(xì)胞
　　 以獲取的AAV-EGF病毒轉(zhuǎn)染MSCs細(xì)胞，分別于培養(yǎng)3d、14d、27d后