重組腺病毒介導(dǎo)的人表皮生長(zhǎng)因子基因體外轉(zhuǎn)染人牙髓干細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)將EGF基因CDS片段亞克隆至腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1,在體外重組至腺病毒載體pAd/BL-DEST,構(gòu)建重組腺病毒載體,并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行腺病毒包裝,獲得重組腺病毒rAd-EGF。將重組腺病毒rAd-EGF在體外感染指數(shù)生長(zhǎng)期人牙髓干細(xì)胞,分析人牙髓干細(xì)胞被轉(zhuǎn)染后EGF蛋白的表達(dá)情況,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供材料及數(shù)據(jù)。
　　方法:在體外用含有10％胎牛血清的DEME培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞至第三

2、代,鏡下觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)情況。雙酶切pCR4-TOPO-EGF及腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1,1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后分別回收EGF片段的帶和線狀pYr-adshuttle-1載體帶,連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,并進(jìn)行擴(kuò)增,提取重組質(zhì)粒pYr-adshuttle-1-EGF,進(jìn)行酶切鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒采用體外同源重組將EGF表達(dá)框亞克隆至腺病毒表達(dá)載體pAd/PL-DEST, XbaI酶切重組腺病毒載體pA

3、d-EGF,進(jìn)行酶切鑒定。用PacI酶切pAd-EGF使重組腺病毒載體線性化后轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293,包裝成重組腺病毒rAd-EGF,PCR鑒定并測(cè)定病毒滴度。感染前24h取指數(shù)生長(zhǎng)期的人牙髓干細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⑵浞譃?組:重組腺病毒rAd-EGF感染組、對(duì)照腺病毒rAd-NC陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70％時(shí),感染組和陰性對(duì)照組加入100MOI重組腺病毒或?qū)φ障俨《?空白組加等量DEME培養(yǎng)液,置于37℃、5％C02培養(yǎng)

4、箱中培養(yǎng)4小時(shí),更換培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM,培養(yǎng)48h后胰酶消化收集各組細(xì)胞進(jìn)行Western-blot,檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后各組EGF的蛋白表達(dá)差異。
　　結(jié)果:人牙髓干細(xì)胞在鏡下成梭形或多角形,2～3個(gè)不等突起,生長(zhǎng)情況良好。 pYr-ads-1-EGF經(jīng)KpnI、XhoI酶切鑒定分析表明腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1-EGF構(gòu)建成功。pAd-EGF進(jìn)行XbaI酶切鑒定和測(cè)序鑒定,確定和目的序列一致,腺病毒

5、載體pAd-EGF構(gòu)建成功。經(jīng)PCR鑒定,重組腺病毒rAd-EGF包裝成功。重組腺病毒rAd-EGF感染DPSC細(xì)胞48h后,Western-blot檢測(cè)各組EGF的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示重組腺病毒rAd-EGF感染組的EGF的蛋白表達(dá)水平均顯著高于其他兩對(duì)照組(p<0.05)。
　　結(jié)論:體外成功培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞至第三代,細(xì)胞生長(zhǎng)良好,增殖情況正常。酶切鑒定表明成功構(gòu)建了重組腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1-EGF和重組