EGFR和UCH-L1在乳腺癌細(xì)胞耐藥、增殖和浸潤轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制.pdf

1、前言
　　 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是表皮生長因子(EGF)參與細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體，屬于HER家族的成員之一。EGFR的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：①EGFR在阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞株MCF7/Adr(adriamycin resistant MCF7)中高表達(dá)，但在其相應(yīng)敏感株MCF7中表達(dá)量

2、很低；②P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)相關(guān)化療藥物在體外可以增強(qiáng)耐藥乳腺癌細(xì)胞株MCF7/Adr中細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)物(extracellular matrix metalloproteinaseinducer，EMMPRIN)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，增強(qiáng)耐藥乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，而該過程可以被EGFR抑制劑阻斷。提示EGFR在調(diào)控

3、耐藥乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力方面發(fā)揮著重要的作用，但具體作用及其機(jī)制國內(nèi)外尚未見系統(tǒng)性的研究報(bào)道。
　　 化療耐藥是乳腺癌治療面臨的最大難題之一，其中最重要的機(jī)制即為ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的表達(dá)，包括P-gp、乳腺癌耐藥蛋白(Breast CancerResistance Protein，BCRP，又名ABCG2)等，其產(chǎn)物具有ATP依賴性的藥物泵作用，能將多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，

4、導(dǎo)致耐藥。本課題組前期發(fā)現(xiàn)在耐藥乳腺癌細(xì)胞株MCF7/Adr培養(yǎng)基中加入不同濃度的P-gp底物化療藥物后，EGFR的表達(dá)水平明顯高于對照組，說明乳腺癌化療藥物耐藥與EGFR之間也許存在著某些關(guān)聯(lián)；我們同時(shí)也發(fā)現(xiàn)處于不同細(xì)胞周期的MCF7細(xì)胞在P-gp底物化療藥物誘導(dǎo)下侵襲遷移能力不同，提示細(xì)胞周期的改變不僅與腫瘤的侵襲能力有關(guān)，而且可能參與了化療藥物的耐受調(diào)控。有文獻(xiàn)報(bào)道在加入EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478后平滑肌瘤細(xì)胞周期分布發(fā)

5、生明顯改變，但EGFR在此過程中作用的具體機(jī)制未見報(bào)道。我們早期發(fā)現(xiàn)阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞株MCF7/Adr的增殖能力明顯高于敏感株MCF7，通常這是由于細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換加快導(dǎo)致的，所以我們將致力于闡明EGFR在介導(dǎo)乳腺癌耐藥細(xì)胞周期改變中發(fā)揮的作用，并且探索其是否與化療藥物的耐受性有關(guān)。
　　 泛素羧基末端水解酶1(ubiquitin carboxy terminal hydrolase1，UCH-L1)為泛素羧基末端水解酶

6、家族(ubiquitin carboxy terminal hydrolases，UCHs)中的一個(gè)成員，它除了傳統(tǒng)認(rèn)為的去泛素化作用外，還具有泛素連接酶和穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)泛素單體的功能。我們課題組的前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：①耐藥乳腺癌細(xì)胞株MCF7/Adr細(xì)胞比敏感株MCF7細(xì)胞表達(dá)UCH-L1水平較高；②在阿霉素誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞耐藥過程中，UCH-L1的表達(dá)上調(diào)與細(xì)胞耐藥性的增強(qiáng)和侵襲、遷移能力的提高正相關(guān)；③UCH-L1可以通過調(diào)節(jié)P-gp、E

7、MMPRIN和MMPs的表達(dá)及P-gp和EMMPRIN的泛素化降解，參與調(diào)控人乳腺癌細(xì)胞的耐藥和侵襲遷移。有文獻(xiàn)報(bào)道，EGFR的單泛素化對于誘導(dǎo)其內(nèi)化和降解是必需的，阻斷泛素化的過程可以阻抑EGFR的內(nèi)化，而去泛素化酶是否參與了耐藥乳腺癌中EGFR的降解及其相關(guān)機(jī)制未見系統(tǒng)報(bào)道?；赨CH-L1與EGFR在耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF7/Adr和敏感株MCF7中表達(dá)水平的對應(yīng)性，我們推測耐藥乳腺癌細(xì)胞中EGFR的降解可能受到了泛素蛋白酶體途徑調(diào)

8、節(jié)。
　　 根據(jù)上述陳述，我們有以下幾個(gè)推測：①EGFR參與人耐藥乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力的調(diào)控；②EGFR促進(jìn)了細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換，最終導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞耐藥性的改變；③耐藥乳腺癌細(xì)胞中EGFR的降解受到了泛素蛋白酶體途徑的調(diào)節(jié)。為了證實(shí)我們的推測，本課題設(shè)想通過EGFR siRNA干擾MCF7/Adr細(xì)胞和pcDNA3.0-EGFR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞，闡明EGFR對人耐藥乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移、化療耐受性和耐藥相關(guān)蛋白的影響及其

9、機(jī)制；將MCF7細(xì)胞同步化于不同的細(xì)胞周期觀察化療藥物敏感性和耐藥相關(guān)蛋白的變化，驗(yàn)證EGFR是否可以通過調(diào)控細(xì)胞周期來介導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞耐藥性的改變；并進(jìn)一步觀察P-gp底物化療藥物作用下UCH-L1和EGFR的表達(dá)，通過pIRES2-UCH-L1-EGFP(Enhanced Green Fluorecent protein，EGFP，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞和在MCF7/Adr細(xì)胞加入泛素蛋白酶體抑制劑MG-132阻斷

10、泛素蛋白酶降解途徑來觀察EGFR的改變，初步探討UCH-L1對EGFR的調(diào)控作用、泛素降解系統(tǒng)對EGF-EGFR的調(diào)節(jié)及其可能的機(jī)制。以上研究有助于進(jìn)一步明確腫瘤耐藥和浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制，為臨床乳腺癌治療中EGFR靶向治療使用提供理論支持，故本研究是一項(xiàng)具有顯著的臨床和社會效益的重大課題。
　　 第一部分 EGFR促進(jìn)人耐藥乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移和增殖目的明確EGFR對人耐藥乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移和增殖的影響。
　

11、　 方法采用EGFR siRNA雙鏈寡核糖核苷酸干擾耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF7/Adr和pcDNA3.0-EGFR真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染敏感乳腺癌MCF7細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光法檢測轉(zhuǎn)染效率；應(yīng)用transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究EGFR對人乳腺癌細(xì)胞體外侵襲、遷移運(yùn)動能力的影響；應(yīng)用western blot的方法檢測EGFR、EMMPRIN、MMPs的表達(dá)；應(yīng)用細(xì)胞生長曲線法、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的生長和凋亡。
　　 結(jié)果 EGFR s

12、iRNA干擾可以下調(diào)耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF7/Adr細(xì)胞內(nèi)EGFR、EMMPRIN、MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞體外侵襲、遷移能力均有所減弱，生長速度顯著減慢；而進(jìn)行轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-EGFR質(zhì)?？梢陨险{(diào)MCF7細(xì)胞內(nèi)EGFR、EMMPRIN、MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞體外侵襲、遷移能力也均有所增強(qiáng)，生長速度顯著加快。
　　 小結(jié) EGFR可以促進(jìn)人耐藥乳腺癌細(xì)胞的增殖，并通過上調(diào)EMMPRIN、MMP2

13、和MMP9的表達(dá)，增強(qiáng)人耐藥乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 第二部分 EGFR通過調(diào)控細(xì)胞周期介導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞化療耐藥性的改變目的明確EGFR與人乳腺癌細(xì)胞化療耐藥之間的關(guān)系及其機(jī)制。
　　 方法采用EGFR siRNA雙鏈寡核糖核苷酸干擾耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF7/Adr和pcDNA3.0-EGFR真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染敏感乳腺癌MCF7細(xì)胞；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；應(yīng)用MTT檢測藥敏活性；應(yīng)用血清饑餓法和胸腺嘧啶雙阻

14、斷法分別同步化細(xì)胞周期于G1和S期；應(yīng)用western blot的方法檢測P-gp、ABCG2、MRP1、cyclin D1、CDK4、p21、p27和PCNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果進(jìn)行EGFR siRNA干擾后的MCF7/Adr細(xì)胞內(nèi)S期比例明顯下降，G1期比例明顯增高，P-gp、ABCG2、cyclin D1、CDK4的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，p21和p27的表達(dá)水平明顯上調(diào)，細(xì)胞對阿霉素和紫杉醇的耐受性明顯降低，MRP1和PCNA

15、表達(dá)水平未見明顯改變；轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-EGFR質(zhì)粒后MCF7細(xì)胞內(nèi)S期比例明顯增高，G1期比例明顯下降，P-gp、ABCG2、cyclin D1、CDK4的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，p21和p27的表達(dá)水平明顯下調(diào)，細(xì)胞對阿霉素和紫杉醇的耐受性明顯增高，但MRP1和PCNA表達(dá)同樣未見明顯改變。將MCF7細(xì)胞分別同步化于G1和S期后，S期的細(xì)胞內(nèi)P-gp、ABCG2的表達(dá)水平以及對阿霉素和紫杉醇的耐藥性也明顯高于G1期和未同步化對照組。<

16、br>　　 小結(jié) EGFR通過上調(diào)cyclin D1、CDK4，下調(diào)p21和p27促進(jìn)了細(xì)胞周期G1/S的轉(zhuǎn)換，使S期細(xì)胞比例升高，從而促進(jìn)了P-gp、ABCG2的表達(dá)，增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞耐藥性。
　　 第三部分 UCH-L1對人耐藥乳腺癌細(xì)胞中EGFR表達(dá)的調(diào)控目的初步探討P-gp底物化療藥物對耐藥乳腺癌細(xì)胞UCH-L1和EGFR表達(dá)的影響，并明確EGFR的降解是否受到泛素蛋白酶體途徑的調(diào)節(jié)。
　　 方法在耐藥乳腺癌細(xì)

17、胞株MCF7/Adr及其敏感乳腺癌細(xì)胞株MCF7培養(yǎng)過程中分別加入不同劑量的P-gp底物化療藥物(阿霉素和紫杉醇)以及非P-gp底物化療藥物(博萊霉素)，檢測癌細(xì)胞UCH-L1、EGFR、EMMPRIN、MMP2和MMP9表達(dá)水平的改變；采用pIRES2-UCH-L1-EGFP(EGFP：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞和在MCF7/Adr細(xì)胞中加入泛素蛋白酶體抑制劑MG-132，觀察EGFR表達(dá)量的變化。
　

18、　 結(jié)果分別加入不同濃度的阿霉素和紫杉醇之后，耐藥乳腺癌細(xì)胞株MCF7/Adr中的UCH-L1、EGFR、EMMPRIN、MMP2和MMP9蛋白水平顯著上調(diào)，這種作用不具有劑量依賴性，而敏感乳腺癌細(xì)胞株MCF7沒有相應(yīng)的變化。加入博萊霉素之后，無論MCF7/Adr還是MCF7細(xì)胞中的上述各項(xiàng)檢測指標(biāo)均沒有顯著改變；轉(zhuǎn)染pIRES2-UCH-L1-EGFP后MCF7細(xì)胞內(nèi)的EGFR表達(dá)量明顯增高；并且與未加藥組和溶劑組相比，在耐藥乳腺癌