PRR11在乳腺癌中的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌是世界范圍女性最常見的惡性腫瘤，占女性全部惡性腫瘤的22％左右，是危害女性健康的最主要的疾病之一。乳腺癌曾經(jīng)在中國(guó)等發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率較低，然而隨著社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境等諸多因素的變化，乳腺癌的發(fā)病率在全球范圍迅速增加，僅僅10年時(shí)間乳腺癌的總發(fā)病率提高了近10倍，乳腺癌在中國(guó)更是以每年2.7％的比例快速增長(zhǎng)。流行病學(xué)資料顯示，基因的異常擴(kuò)增和突變及遺傳易感性改變?cè)谌橄侔┑陌l(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用。近年來隨著對(duì)一些重要

2、癌基因和抑癌基因生物學(xué)功能的不斷深入研究，乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制被逐漸闡釋。
　　基于新的癌基因和腫瘤靶標(biāo)的靶向治療也在乳腺癌的治療中發(fā)揮了重要作用，隨著分子分型及腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出，乳腺癌的研究正逐步從以往的循證治療、經(jīng)驗(yàn)治療向新的以全基因組測(cè)序和基因突變?yōu)閷?dǎo)向的個(gè)體化治療轉(zhuǎn)變，在這個(gè)大環(huán)境下，探索新的乳腺癌關(guān)鍵癌基因，發(fā)現(xiàn)其新的調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)作用，并實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化正成為近年來乳腺癌研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　研究發(fā)

3、現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞來源于乳腺上皮細(xì)胞，能夠表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物，且存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象;亦有報(bào)道稱在乳腺癌細(xì)胞系中上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin)可以顯著提高乳腺癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移能力，并與乳腺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。上述研究均提示EMT乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后過程中發(fā)揮著重要的作用。在我們的前期研究中通過對(duì)過度表達(dá)或干擾PRR11的乳腺癌MCF-7細(xì)胞系及其對(duì)照細(xì)胞系蛋白和基因水平的檢測(cè)表明，PRR11與-catenin表達(dá)呈正

4、相關(guān)，提示我們PRR11在乳腺癌細(xì)胞系中可能正向調(diào)控Wnt/-catenin通路，介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT，進(jìn)而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移能力，并影響乳腺癌患者的預(yù)后。
　　乳腺癌是對(duì)女性健康威脅最大的腫瘤之一，至今其調(diào)控機(jī)制仍不十分清楚，除了ER/PR、HER2、Ki67外尚，可用于臨床診斷的預(yù)后標(biāo)志物及治療方面有效的分子靶點(diǎn)還很缺乏。因此尋找乳腺癌治療靶標(biāo)和預(yù)后標(biāo)志物是目前乳腺癌研究的重要內(nèi)容。PRR11作為一個(gè)重要的腫瘤相關(guān)信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，其對(duì)乳

5、腺癌及生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的調(diào)控尚無報(bào)道。本課題將利用多種特征性乳腺癌細(xì)胞模型、腫瘤轉(zhuǎn)移模型系統(tǒng)研究PRR11在乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用，揭示其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的調(diào)控及分子機(jī)制，并利用大規(guī)模乳腺癌樣本及其臨床病理資料和隨訪信息，系統(tǒng)分析PRR11與乳腺癌臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系，探討PRR11作為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物的應(yīng)用前景，最終為乳腺癌的診斷和治療提供新的靶標(biāo)。
　　第一部分 PRR11在乳腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)及其臨床意義
　

6、　目的:檢測(cè)PRR11在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，分析PRR11表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性，探討其預(yù)后預(yù)測(cè)意義。
　　方法:采用免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡檢測(cè)PRR11在乳腺癌細(xì)胞MCF-7、SK-BR3、MDA-MB-231和正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)乳腺癌組織與正常組織中PRR11的表達(dá)差異，明確乳腺癌組織中PRR11的表達(dá)與腫瘤分期、增殖指數(shù)

7、、組織分級(jí)、分子分型等臨床病理特征的相關(guān)性。通過生存分析和Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型探討PRR11對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)意義。
　　結(jié)果:免疫熒光顯示PRR11主要表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞漿內(nèi)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡結(jié)果提示，PRR11的mRNA和蛋白質(zhì)在乳腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于正常乳腺組織和上皮細(xì)胞系。免疫組化結(jié)果顯示，PRR11高表達(dá)的乳腺癌組織中增殖標(biāo)志物Ki67的表達(dá)明顯高于PRR11低表達(dá)的乳腺癌組織，PRR11的表

8、達(dá)隨著乳腺癌分期的提高而增加。PRR11的表達(dá)與腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理分期、孕激素受體狀態(tài)密切相關(guān)，但與年齡和淋巴結(jié)狀態(tài)無明顯相關(guān)性。生存分析提示，PRR11高表達(dá)患者生存期較低表達(dá)者明顯縮短，PRR11可作為乳腺癌患者獨(dú)立的不良預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　結(jié)論:PRR11在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于乳腺正常組織和上皮細(xì)胞，乳腺癌組織中PRR11表達(dá)與增殖指數(shù)、是否轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān)，其可作為PRR11可作為乳腺癌患者獨(dú)立的

9、不良預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　第二部分 PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　目的:探討PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　方法:構(gòu)建慢病毒體介導(dǎo)的PRR11過表達(dá)和沉默體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中PRR11表達(dá)的穩(wěn)定上下調(diào)。采用MTT、EdU、平板克隆和TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。篩選PRR11穩(wěn)定上調(diào)和沉默的乳腺癌MCF-

10、7細(xì)胞及各自對(duì)照細(xì)胞，構(gòu)建裸鼠皮下種植瘤模型，檢測(cè)PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　結(jié)果:細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRR11過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞活力、EdU陽性細(xì)胞百分比和平板克隆形成數(shù)目較對(duì)照組明顯升高，PRR11表達(dá)下調(diào)后乳腺癌細(xì)胞的上述生物學(xué)行為較對(duì)照組明顯受到抑制，且細(xì)胞凋亡數(shù)目較對(duì)照組明顯增多。荷瘤裸鼠模型結(jié)果顯示，PRR11表達(dá)上調(diào)后MCF-7細(xì)胞的成瘤體積、質(zhì)量和Ki67的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，PRR11表達(dá)

11、下調(diào)后上述指標(biāo)較對(duì)照組明顯降低。
　　結(jié)論:PRR11表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和體內(nèi)成瘤能力;PRR11表達(dá)下調(diào)則會(huì)抑制乳腺癌增殖和體內(nèi)成瘤，并可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　第三部分 PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響
　　目的:探討PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響
　　方法:采用慢病毒體介導(dǎo)的PRR11過表達(dá)和沉默體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中PRR11表

12、達(dá)的穩(wěn)定上下調(diào)。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。檢測(cè)PRR11表達(dá)上調(diào)后乳腺癌MCF-7細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)志物(E-cadherin、Fibronectin和Vimentin)的改變。
　　結(jié)果:PRR11表達(dá)上調(diào)后，乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞劃痕愈合率和侵襲數(shù)量較對(duì)照組顯著提高，PRR11表達(dá)下調(diào)則會(huì)抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。PRR11表達(dá)上調(diào)后MCF-7細(xì)

13、胞發(fā)生EMT改變，E-cadherin表達(dá)降低，F(xiàn)ibronectin和Vimentin表達(dá)升高。
　　結(jié)論: PRR11表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，PRR11表達(dá)下調(diào)則會(huì)抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　第四部分 PRR11調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制
　　目的:探討PRR11調(diào)控乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制
　　方法:選取MCF-7細(xì)胞，采用免疫印跡和熒光定量

14、PCR檢測(cè)PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)β-catenin及其下游信號(hào)分子cyclinD1、c-myc、E-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(TOP/FOP-flash)檢測(cè)對(duì)PRR11表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)β-catenin作為轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。采用小干擾RNA下調(diào)β-catenin的表達(dá)后，免疫印跡和熒光定量PCR檢測(cè)β-catenin及其下游信號(hào)分子表達(dá)變化，TOP/FOP-flash檢測(cè)β-catenin的轉(zhuǎn)錄

15、因子活性，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖和侵襲變化，驗(yàn)證PRR11通過β-catenin通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。采用免疫組化檢測(cè)臨床乳腺癌標(biāo)本中的PRR11和β-catenin表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:PRR11表達(dá)上調(diào)后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞中β-catenin的總表達(dá)量和核內(nèi)表達(dá)量均明顯升高，其調(diào)控的下游基因cyclinD1、c-myc、E-cadherin和Vimentin表達(dá)也較對(duì)照組升高，受β-catenin轉(zhuǎn)錄激活的質(zhì)粒熒光

16、強(qiáng)度(TOP/FOP)明顯增強(qiáng)。反之，當(dāng)PRR11表達(dá)下調(diào)后，上述分子的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低。當(dāng)同時(shí)下調(diào)3-catenin的表達(dá)后，PRR11上調(diào)所引發(fā)的cyclinD1、c-myc和Vimentin表達(dá)增加被抵消，而E-cadherin表達(dá)則有所恢復(fù)。此外，PRR11上調(diào)所引起的TOP/FOP比值升高也被抵消，MTT和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-catenin表達(dá)下調(diào)可以抵消PRR11過表達(dá)所引起的MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲能力