漢灘病毒G1蛋白胞質(zhì)區(qū)ITAM樣基序功能的研究.pdf

1、要漢坦病毒(hantaviruses,HV)歸屬于布尼亞病毒科，是有囊膜的單股分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒，其基因組由L、M、S三個片段組成，分別編碼RNA聚合酶、兩種囊膜糖蛋白(G1和G2)和核衣殼蛋白(NP)，囊膜糖蛋白對于病毒的組織細(xì)胞嗜性和致病性起決定性作用。HV感染人類后主要引起兩類疾病——腎綜合征出血熱(HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(HPS)。亞洲HFRS疫區(qū)流行毒株漢灘病毒(Hantaanvirus，HTNV)所致的腎綜合征出血熱

2、(Hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)重危癥多，病死率高，其發(fā)病機(jī)制迄今仍未闡明，也無特效的治療措施。 免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，ITAM)是與免疫受體活化性信號傳遞有關(guān)的一段以兩個酪氨酸殘基為中心的序列，在啟動免疫細(xì)胞的活化和增殖中起關(guān)鍵作用。不僅機(jī)體許多重要的免疫受體含有ITAM，而且一些病毒基因

3、編碼的蛋白也含有ITAM，在病毒的致病機(jī)制中發(fā)揮不容忽視的作用。近年研究表明，HPS相關(guān)HV的囊膜糖蛋白1(glycoprotein1，G1)胞質(zhì)區(qū)尾段均含有標(biāo)準(zhǔn)的ITAM，具有與一些重要的免疫受體ITAM相似的功能。我們通過對HFRS相關(guān)HTNV的G1氨基酸序列進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)HTNV的G1胞質(zhì)區(qū)尾段存在ITAM樣基序(ITAM-likesequences)，其基本形式為YXXLX9YXXT。鑒于HFRS相關(guān)病毒與HPS相關(guān)病毒同屬

4、于漢坦病毒屬，在基因結(jié)構(gòu)上有較高的同源性，已知結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的功能也基本相似，兩類病毒引起的臨床疾病的基本病理變化和臨床表現(xiàn)(如高熱、出血、低血壓休克等)也大體相同，而且有研究發(fā)現(xiàn)ITAM中第二個YXXL/I中的L/I可以由其它若干氨基酸如脯氨酸(P)取代，這種所謂的ITAM樣基序仍具有標(biāo)準(zhǔn)ITAM的功能，因此，我們推測HTNV的G1蛋白ITAM樣基序應(yīng)具有與標(biāo)準(zhǔn)ITAM相同或相似的功能，并可能參與HTNV的致病機(jī)制特別是對人體免疫細(xì)

5、胞和內(nèi)皮細(xì)胞的作用和損傷機(jī)理。 基于上述學(xué)術(shù)假設(shè)，結(jié)合我們近年有關(guān)HV受體研究所獲信息，本研究從以下三個部分漸次深入地探討HTNVG1蛋白胞質(zhì)區(qū)尾段ITAM樣基序的功能： 1.HTNVG1蛋白ITAM樣基序及其突變體的克隆及表達(dá)采用RT-PCR方法，擴(kuò)增了2段包含HTNVG1蛋白ITAM樣基序編碼基因，并人工合成了1段該基序中2個保守酪氨酸殘基突變基序編碼基因，然后應(yīng)用Gateway技術(shù)將目的基因經(jīng)由Gateway(R)

6、入門載體pENTRTM/D-TOPO亞克隆至pDESTM15表達(dá)載體中，構(gòu)建成2個含HTNVG1胞質(zhì)區(qū)尾段ITAM樣基序編碼基因表達(dá)載體pDEST-74ITAM、pDEST-33ITAM和1個含保守酪氨酸殘基突變的G1ITAM樣基序編碼基因表達(dá)載體pDEST-ITAM-FF(Y615F，Y628F)。在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)下，目的蛋白在大腸埃希桿菌中得到高效地表達(dá)，免疫印跡證實(shí)目的蛋白與GST融合表達(dá)。誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白經(jīng)純化后，獲得了3種較高

7、純度的、與GST融合的G1ITAM樣基序及其突變基序的重組蛋白GST-74G1(含HTNVG1蛋白胞質(zhì)區(qū)aa569-642)，GST-33G1(aa602-634)和GST-G1-ITAM(aa602-634的Y615/628F)，為進(jìn)一步探討HTNVG1蛋白ITAM樣基序的功能奠定了基礎(chǔ)。 2.G1ITAM樣基序與Src和Syk家族激酶的體外相互作用 2.1G1ITAM樣基序與細(xì)胞磷酸化蛋白或激酶共沉淀首先，應(yīng)用人工合

8、成的磷酸化G1ITAM樣基序Ac-PGCpYRTLNLFRYKSRCpYIFT-NH2從Jurkat細(xì)胞和Raji細(xì)胞裂解物中共沉淀蛋白復(fù)合物，然后用[γ-32P]ATP體外代謝標(biāo)記沉淀的激酶和磷酸化蛋白，最后，進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，放射自顯影顯示，G1ITAM樣基序分別從Jurkat細(xì)胞和Raji細(xì)胞裂解物中共沉淀出5～9種激酶或磷酸化蛋白。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步探討該基序能否與TCR和BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中關(guān)鍵的蛋白酪氨酸激酶Sr

9、c及其下游的Syk家族激酶相互作用。 2.2G1ITAM樣基序與Src家族激酶Fyn和Lyn相互作用2.2.1體外激酶共沉淀-免疫印跡分析G1ITAM樣基序與Lyn相互作用。從Raji細(xì)胞裂解液中，用第一部分中獲得的三種融合蛋白GST-74G1、GST-33G1和GST-G1-ITAM-行體外激酶共沉淀，共沉淀的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，用抗Lyn抗體進(jìn)行Westernblot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包含G1ITAM樣基序的融合蛋白可

10、以從Raji細(xì)胞裂解液中共沉淀Lyn，而G1ITAM樣基序中2個保守的酪氨酸位點(diǎn)突變的融合蛋白GST-G1-ITAM-及GST不能從Raji細(xì)胞裂解液中共沉淀Lyn。2.2.2體外磷酸化分析G1ITAM樣基序與Fyn相互作用。將融合蛋白GST-74G1、GST-33G1和GST-G1-ITAM作為Fyn-active的磷酸化底物，進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)，用[γ-32P]ATP體外標(biāo)記后進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，放射自顯影顯示，包含G1I

11、TAM樣基序的融合蛋白GST-74G1、GST-33G1可以被Fyn高水平磷酸化，而G1ITAM樣基序中2個保守的酪氨酸位點(diǎn)突變的融合蛋白GST-G1-ITAM-磷酸化水平明顯低于前兩者。 2.3G1ITAM樣基序與Syk家族激酶Syk和ZAP-70相互作用體外激酶共沉淀-免疫印跡分析G1ITAM樣基序與Syk和ZAP-70相互作用。從Jurkat細(xì)胞裂解液中，用純化的三種融合蛋白GST-74G1、GST-33G1和GST-G1

12、-ITAM-行體外激酶共沉淀，共沉淀的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，分別用抗Syk和抗ZAP-70抗體進(jìn)行Westernblot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含G1ITAM樣基序的融合蛋白可以從Jurkat細(xì)胞裂解液中共沉淀Syk和ZAP-70，而ITAM樣基序中2個保守的酪氨酸位點(diǎn)突變的融合蛋白GST-G1-ITAM-及GST不能從與上述2種蛋白酪氨酸激酶共沉淀。 3.哺乳動物細(xì)胞雙雜交驗(yàn)證G1ITAM樣基序與Syk的相互作用為了進(jìn)一步驗(yàn)證H

13、TNVG1蛋白ITAM樣基序與蛋白酪氨酸激酶Syk可以在細(xì)胞內(nèi)相互作用，采用Promega公司的CheckmateTM哺乳類雙雜交系統(tǒng)，將HTNVG1胞質(zhì)區(qū)尾段ITAM樣基序及其突變基序的編碼序列和Syk全長cDNA分別克隆入pACT和pBIND載體中，構(gòu)建成用于驗(yàn)證G1ITAM樣基序與Syk相互作用的哺乳動物細(xì)胞雙雜交系統(tǒng)的相關(guān)質(zhì)粒pBIND-Syk、pBIND-ITAM、pBIND-ITAM-L、pBIND-ITAM-FF、pACT

14、-Syk、pACT-ITAM、pACT-ITAM-L和pACT-ITAM-FF，將pACT-ITAM/pACT-ITAM-L/pACT-ITAM-FF、pBIND-Syk與該系統(tǒng)的報(bào)告質(zhì)粒pG5luc共轉(zhuǎn)染CHO和COS-7細(xì)胞，同時設(shè)立一系列的對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染后36h裂解細(xì)胞，用DLRTM雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測螢火蟲熒光素酶和海腎螢光素酶活性，其中海腎螢光素酶作為內(nèi)參照以監(jiān)控轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pACT-ITAM和pBIND-Syk