香煙煙霧提取物對氣道上皮細(xì)胞損傷作用機(jī)制的研究.pdf

1、呼吸道上皮是肺抵御外界環(huán)境損傷的第一道門戶。病原微生物和環(huán)境污染等理化因子的刺激，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)完整性破壞和功能喪失，是慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)和哮喘等很多呼吸道疾病的起始環(huán)節(jié)和病理基礎(chǔ)。氣道上皮細(xì)胞完整性的修復(fù)和維持有助于預(yù)防和延緩呼吸道疾病的發(fā)生發(fā)展，細(xì)胞的粘附遷移和增殖是其修復(fù)能力的重要標(biāo)志。粘著斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)是人們發(fā)現(xiàn)

2、的與腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等很多細(xì)胞粘附遷移和增殖活性密切相關(guān)的非受體蛋白酪氨酸激酶，細(xì)胞內(nèi)源性FAK家族激酶相互作用蛋白200(FAK-familyinteractingproteinof200kDa，F(xiàn)IP200)對FAK活性有負(fù)調(diào)節(jié)作用；香煙煙霧提取物(cigarettesmokingextract，CSE)是導(dǎo)致呼吸道上皮細(xì)胞損傷的重要因素，F(xiàn)AK和FIP200在CSE所致氣道上皮細(xì)胞損傷粘附遷移和增殖中的作用如何?我們作了以下三

3、方面的研究。 一、局灶粘著斑激酶對氣道上皮細(xì)胞粘附遷移和增殖的影響目的：研究FAK磷酸化對細(xì)胞外基質(zhì)成份誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞粘附遷移和增殖的影響，探討粘著斑激酶活化對氣道上皮細(xì)胞損傷后修復(fù)影響的機(jī)制。 方法：通過纖維連接蛋白(finbronectin，F(xiàn)N)誘導(dǎo)培養(yǎng)氣道上皮細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞粘附率；用損傷修復(fù)試驗(yàn)測定細(xì)胞遷移速度；利用四唑鹽(MTT)比色實(shí)驗(yàn)研究氣道上皮細(xì)胞增殖情況，采用流式細(xì)胞術(shù)分析氣道上皮細(xì)胞細(xì)

4、胞周期各期分布，以Westernblot和免疫共沉淀檢測FAK表達(dá)水平及其酪氨酸磷酸化程度；以FAK反義寡核苷酸(oligodeoxynucleotides，ODNs)經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察其對FAK磷酸化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞在細(xì)胞周期各期分布和細(xì)胞粘附遷移的影響。 結(jié)果：FN誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞MTT吸光度值明顯增強(qiáng)，G1期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，S期和G2期細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞粘附率和遷移速度顯著增高，同時(shí)FAK表達(dá)水平及其酪氨酸磷酸

5、化程度顯著增高；經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染了反義FAK寡核苷酸的氣道上皮細(xì)胞MTT吸光度值顯著降低，G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多，S期和G2期細(xì)胞數(shù)顯著減少，細(xì)胞粘附率和遷移速度顯著降低，F(xiàn)AK表達(dá)水平及其酪氨酸磷酸化程度降低，且與G1期細(xì)胞數(shù)量的增多呈顯著負(fù)相關(guān)，與S期、G2期細(xì)胞數(shù)量、MTT吸光度值、細(xì)胞粘附率和遷移速度呈明顯正相關(guān)。 結(jié)論：FAK是細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞增殖的重要信號分子，其活化促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞的粘附遷移和增殖，在氣道上皮細(xì)

6、胞損傷后修復(fù)過程中起重要作用。 二、FIP200對氣道上皮細(xì)胞粘附遷移和增殖的影響目的：研究FIP200(FAK-familyinteractingpro矗mof200kDa)對細(xì)胞外基質(zhì)成份FN誘導(dǎo)的呼吸道上皮細(xì)胞粘附遷移和增殖的影響及其作用機(jī)制。方法：通過FN誘導(dǎo)培養(yǎng)呼吸道上皮細(xì)胞粘附遷移和增殖，以FIP200反義寡核苷酸(ODNs)經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞粘附率；用損傷修復(fù)試驗(yàn)測定細(xì)胞遷移速度；利用四唑鹽(M

7、TT)比色實(shí)驗(yàn)研究呼吸道上皮細(xì)胞增殖情況；采用流式細(xì)胞術(shù)分析呼吸道上皮細(xì)胞細(xì)胞周期各期分布情況；以Westernblot檢測FIP200和FAK蛋白表達(dá)水平；以免疫共沉淀檢測FIP200和FAK結(jié)合情況和FAK磷酸化程度。結(jié)果：FN誘導(dǎo)的呼吸道上皮細(xì)胞MTT吸光度明顯增強(qiáng)，G1期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，S期和G2期細(xì)胞數(shù)量明顯增多，同時(shí)FAK表達(dá)水平及其酪氨酸磷酸化程度顯著增高，F(xiàn)IP200表達(dá)有降低趨勢，F(xiàn)AK與FIP200的結(jié)合程度顯著減

8、低；經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染了反義FIP200寡核苷酸的氣道上皮細(xì)胞MTT吸光度值顯著增高，G1期細(xì)胞數(shù)明顯減少，S期和G2期細(xì)胞數(shù)顯著增多，細(xì)胞粘附率和遷移速度顯著增高，F(xiàn)IP200表達(dá)水平顯著降低，F(xiàn)AK表達(dá)水平無明顯變化，與FIP200結(jié)合的FAK顯著降低，F(xiàn)AK酪氨酸磷酸化程度明顯增高；而且FIP200表達(dá)水平及FIP200與FAK的結(jié)合程度與G1期細(xì)胞數(shù)量呈顯著正相關(guān)，與S期、G2期細(xì)胞數(shù)量、MTT吸光度、細(xì)胞粘附率和遷移速度呈明顯負(fù)相關(guān)

9、。 結(jié)論：內(nèi)源性FIP200和FAK的結(jié)合抑制FAK的活化，從而抑制呼吸道上皮細(xì)胞粘附遷移和增殖，內(nèi)源性FIP200作為FAK的抑制劑而存在。 三、香煙煙霧提取物對氣道上皮細(xì)胞粘附遷移和增殖的影響及其機(jī)制研究 目的：研究香煙煙霧提取物對氣道上皮細(xì)胞粘附遷移和增殖的影響及其作用機(jī)制。 方法：通過FN誘導(dǎo)培養(yǎng)氣道上皮細(xì)胞，以CSE干預(yù)細(xì)胞；用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞粘附率；用損傷修復(fù)試驗(yàn)測定細(xì)胞遷移速度；利用四唑鹽

10、(MTT)比色實(shí)驗(yàn)研究呼吸道上皮細(xì)胞增殖情況；采用流式細(xì)胞術(shù)分析呼吸道上皮細(xì)胞細(xì)胞周期各期分布情況；以Westernblot檢測FIP200和FAK蛋白表達(dá)水平；以免疫共沉淀檢測FIP200和FAK結(jié)合情況和FAK磷酸化程度。 結(jié)果：與對照組相比，CSE干預(yù)的氣道上皮細(xì)胞MTT吸光度明顯降低，G1期細(xì)胞數(shù)量明顯增多，S期和G2期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞粘附率和遷移速度均顯著降低(P均＜0.01)，F(xiàn)IP200mRNA、FIP200

11、的表達(dá)水平以及FIP200與FAK的連接均顯著增高(P均＜0.01)，而且這些變化均隨CSE干預(yù)時(shí)間的延長和CSE濃度的增大而增大；氣道上皮細(xì)胞FIP200表達(dá)水平和FIP200與FAK連接的增高均與G1期細(xì)胞數(shù)量的增多呈正相關(guān)(P均＜0.01)，與S期和G2期細(xì)胞數(shù)量的減少及細(xì)胞粘附率和遷移速度的降低呈負(fù)相關(guān)(P均＜0.01)。 結(jié)論：CSE導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞高表達(dá)FIP200，并促進(jìn)FIP200與FAK的連接而抑制FAK活化，