耳-迷走反射及耳針抗癲癇的效應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、本研究從行為學(xué)、電生理學(xué)等角度分別觀察了耳針對(duì)癲癇大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，NTS神經(jīng)元放電，硬膜外腦電圖(electroencephalogram，EEG)的影響，以及局部冷凍NTS對(duì)耳針抗癲癇效應(yīng)的影響，和應(yīng)用交感興奮劑、拮抗劑對(duì)癲癇大鼠EEG的影響，試圖從耳一迷走反射的角度探討耳針抑制癲癇的作用機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)一、耳針預(yù)處理對(duì)戊四氮致癲癇大鼠行為學(xué)表現(xiàn)的影響。 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年Sprague-Dawley雄性大鼠42只，

2、體重300±28g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)。 1.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程：將動(dòng)物分為3組。模型組(n=14)給予大鼠腹腔注射戊四氮(pentylenetetrazol，PTZ)60 mg/kg造成急性癲癇模型，后觀察30 min大鼠行為學(xué)的表現(xiàn)，耳甲治療組(n=15)和大椎治療組(n=13)分別在造模前電針耳甲或“大椎”穴30 min，后立即腹腔注射PTZ，觀察30 min大鼠行為學(xué)的表現(xiàn)。行為學(xué)表現(xiàn)根據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)

3、準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。電針刺激參數(shù)：強(qiáng)度，1 mA；頻率，20 Hz；脈寬，500 μs；刺激30 s，間隔5 min，持續(xù)30 min。 1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果：模型組大鼠腹腔注射PTZ 40s左右出現(xiàn)癲癇發(fā)作，開(kāi)始表現(xiàn)為小發(fā)作，如凝視，點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)，雙前肢抬起，陣攣等，1-2 min出現(xiàn)大發(fā)作，表現(xiàn)為后肢伸直，抽搐，跌倒伴翻滾，持續(xù)約9.5 s，PTZ后30 min內(nèi)大鼠有1-2次大發(fā)作，多次小發(fā)作。與模型組比較，大椎治療組和耳甲治療組動(dòng)物大發(fā)作

4、潛伏期(即從腹腔注射PTZ到大鼠出現(xiàn)第一次大發(fā)作的時(shí)間)延長(zhǎng)(P<0.05，P<0.01)，行為學(xué)評(píng)分減少(P<0.05，P<0.01)．與大椎治療組比較，除了在首次大發(fā)作持續(xù)時(shí)間上無(wú)顯著差異(P>0.05)，耳甲治療組大發(fā)作潛伏期延長(zhǎng)(P<0.01)，行為學(xué)評(píng)分亦減少(P<0.01)．結(jié)果提示：針刺預(yù)處理可以抑制大鼠癲癇發(fā)作，而且電針耳甲抑制癲癇的效應(yīng)優(yōu)于電針“大椎”穴的效應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)二、耳針對(duì)癲癇大鼠孤束核神經(jīng)元細(xì)胞外放電和腦

5、電圖的影響。 2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠45只，體重300±34g，清潔級(jí)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 2.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程：手術(shù)及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物體溫用計(jì)算機(jī)溫度時(shí)間控制儀維持在37℃。 大鼠麻醉后仰臥，頸部正中切口，游離左側(cè)迷走神經(jīng)干1 cm，將自制C型雙極銀質(zhì)電極刺激端無(wú)張力地鉤于迷走神經(jīng)干上用以刺激迷走神經(jīng)，縫合傷口。然后俯臥，將大鼠頭部用耳棒固定于腦立體定位儀上，根據(jù)大

6、鼠腦立體定位圖譜(Paxinos和Watson，1998)，在前囟前(A：1.0 mm，L：1.0 mm)和前囟后(A：-1.0 mm，L：1.0 mm)及NTS(A：-11.3～-14.3 mm，L：0～2.3 mm，H：4~7 mm)對(duì)應(yīng)顱骨表面，用顱骨鉆鉆孔，暴露硬腦膜。雙銀球電極置于前囟前、后各一小孔內(nèi)硬腦膜上用以記錄EEG。顯微鏡下分離NTS對(duì)應(yīng)處小孔硬腦膜和軟腦膜，暴露小腦皮層，玻璃微電極(阻抗10-20 MΩ)記錄NTS神

7、經(jīng)元放電． 2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 2.3.1造模前后孤束核神經(jīng)元放電頻率和腦電圖的同步變化造模前后共觀察到31個(gè)細(xì)胞。造模后26個(gè)細(xì)胞放電頻率降低(83.87％)，3個(gè)細(xì)胞放電頻率不變(9.68％)，2個(gè)細(xì)胞放電頻率增多(6.45％).經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：NTS細(xì)胞放電頻率造模前為9.48±0.76個(gè)/秒，造模后為4.69±0.36個(gè)/秒。其中26個(gè)放電頻率降低的細(xì)胞，其放電頻率的變化和腦電圖的變化存在同步性，即在細(xì)胞放電頻率降低

8、時(shí)，EEG出現(xiàn)高幅癲癇波，當(dāng)細(xì)胞放電頻率增加時(shí)，EEG癲癇波消失或振幅降低.說(shuō)明當(dāng)NTS細(xì)胞放電頻率減少時(shí)，動(dòng)物癲癇發(fā)作，NTS細(xì)胞放電頻率增多時(shí)，癲癇的發(fā)作消失或減少。這種同步變化在造模后1-3分鐘之內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)，呈節(jié)律性變化，按EEG每出現(xiàn)一次癲癇波記為一次癲癇發(fā)作，最初發(fā)作3次/分，2秒/次，約7-10分鐘內(nèi)持續(xù)增多，在約15分鐘后，呈基本有規(guī)律的變化，平均發(fā)作約6.21±0.48次/分，持續(xù)時(shí)間4.32±0.23秒/次，每分鐘發(fā)作

9、總的持續(xù)時(shí)間為26.83±2.25秒。 實(shí)驗(yàn)三、耳針對(duì)癲癇大鼠行為學(xué)表現(xiàn)、孤束核場(chǎng)電位、皮層場(chǎng)電位的影響。 3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年雄性Spraguc-Dawley大鼠124只，體重298±31g，清潔級(jí)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 3.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程： 3.2.1單電極記錄耳針對(duì)癲癇大鼠皮層場(chǎng)電位的影響(急性實(shí)驗(yàn))手術(shù)過(guò)程中動(dòng)物體溫用計(jì)算機(jī)溫度時(shí)間控制儀維持在37℃。大鼠12只，麻醉后俯臥。根據(jù)大鼠

10、腦立體定位圖譜，暴露初級(jí)體感皮層(SI)(A：-3～－6 mm；L：4～6 mm：H：1.5 mm)，用單根直徑為50μ的金屬微電極記錄癲癇大鼠SI場(chǎng)電位(FPs)，分別觀察5個(gè)部位耳針(包括耳甲腔、耳甲艇、耳垂、耳郭外緣中點(diǎn)、耳尖)30 s前后癲癇大鼠SI FPs的變化．電針刺激參數(shù)：強(qiáng)度，1 mA；頻率，20 Hz；脈寬，500μ s；刺激30s． 3.2.2單電極記錄耳針對(duì)癲癇大鼠行為學(xué)表現(xiàn)、皮層場(chǎng)電位影響(慢性實(shí)驗(yàn))大鼠

11、50只，根據(jù)外耳5個(gè)刺激部位分為5組，每組10只．手術(shù)前部分同3.2.1，將金屬微電極推進(jìn)至SI后，牙托水泥固定電極，動(dòng)物清醒并恢復(fù)一周后，分別觀察5個(gè)部位耳針30 min后癲癇大鼠行為學(xué)表現(xiàn)和SI FPs的變化。電針刺激參數(shù)：強(qiáng)度，1 mA；頻率，20 Hz；脈寬，500μs；刺激30 s，間隔5 min，持續(xù)30 min． 3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 3.3.1單電極記錄耳針對(duì)癲癇大鼠皮層場(chǎng)電位的影響(急性實(shí)驗(yàn))電針耳甲腔(n

12、=14)后，發(fā)作持續(xù)時(shí)間從26.15±2.31秒減少到5.07±0.64秒，減少了21.08±2.06秒(P<0.01)；電針耳甲艇(n=13)后，發(fā)作持續(xù)時(shí)間從25.98±2.17秒減少到4.97±0.43秒，減少了21.01±1.97秒(P<0.01)；電針耳垂(n=13)后，發(fā)作持續(xù)時(shí)間從26.29±2.24秒減少到19.28±1.53秒，減少了7.01±0.82秒(P<0.01)；電針耳郭外緣中點(diǎn)(n=11)后，發(fā)作持續(xù)時(shí)間從2

13、6.38±2.37秒減少到22.16±1.98秒，減少了4.02±0.35秒(P<0.01)；電針耳尖(n=10)后，發(fā)作持續(xù)時(shí)間從26.41±2.23秒減少到19.78±1.62秒，減少了6.63±0.47秒(P<0.01)．每個(gè)部位電針前后大鼠癲癇發(fā)作總的持續(xù)時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明耳針能明顯抑制大鼠癲癇發(fā)作． 實(shí)驗(yàn)四、物理冷凍孤束核對(duì)耳針抗癲癇效應(yīng)的影響。 4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年雄性Sprague-Dawl

14、ey大鼠10只，體重300±30g，清潔級(jí)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 4.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程：手術(shù)及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物體溫用計(jì)算機(jī)溫度時(shí)間控制儀維持在37℃。雙銀球電極記錄硬腦膜外EEG。沿大鼠項(xiàng)部正中切開(kāi)皮膚，充分暴露閂部，并保持閂部水平．將U型管固定于微推進(jìn)器，用微推器將U型管底部輕輕接觸于孤束核在延髓投影區(qū)，即閂部區(qū)域。 4.3結(jié)果： 造模前，孤束核冷凍前、冷凍時(shí)、及冷凍后EEG無(wú)明顯變化。腹腔注射PTZ造模

15、后，同一刺激部位電針前后發(fā)作持續(xù)時(shí)間的差值比較：冷凍NTS中與冷凍NTS前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；撤除冷凍NTS 5 min后與冷凍NTS前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)．結(jié)果表明冷凍NTS時(shí)，耳針抑制癲癇的效應(yīng)減弱，撤除冷凍5 min后，耳針抑制癲癇的效應(yīng)恢復(fù)。說(shuō)明NTS的功能受損削弱了耳針抗癲癇的效應(yīng)． 實(shí)驗(yàn)五、靜脈注射鹽酸腎上腺素，心得安對(duì)癲癇大鼠腦電圖的影響。 5.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年雄性

16、Sprague-Dawley大鼠10只，體重300±30g，清潔級(jí)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供． 5.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程：手術(shù)及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物體溫用計(jì)算機(jī)溫度時(shí)間控制儀維持在37℃．雙銀球電極記錄硬膜外EEG．股靜脈插管，以備靜脈用藥,造模成功后，給予大鼠股靜脈注射鹽酸腎上腺素或心得安，觀察藥物對(duì)癲癇大鼠EEG的影響。 5.3結(jié)果 癲癇發(fā)作較少時(shí)靜脈注射腎上腺素，可以加劇癲癇的發(fā)作；當(dāng)癲癇發(fā)作頻繁時(shí)靜脈注射心得安，

17、可以抑制癲癇的發(fā)作． 結(jié)論： 本項(xiàng)研究從行為學(xué)和電生理的角度探討了耳針治療癲癇的效應(yīng)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：癲癇的發(fā)病表現(xiàn)為行為學(xué)發(fā)作和腦電圖的高幅癲癇波，同時(shí)可能伴有自主神經(jīng)系統(tǒng)功能的失衡．針刺特別是耳針能明顯改善癲癇大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，這種作用可能通過(guò)激活NTS的活動(dòng)來(lái)增強(qiáng)副交感的功能從而去同步化腦電，最終抑制癲癇發(fā)作．刺激耳甲的急性抗癲癇效應(yīng)與VNS的急性抗癲癇效應(yīng)相比無(wú)顯著性差異，且明顯優(yōu)于刺激其它部位的效應(yīng)，可能與耳