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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景:
癲癇(epilepsy)是一種由神經(jīng)元突然異常放電所引起的反復(fù)發(fā)作的短暫的大腦功能失調(diào)的慢性疾病,是僅次于腦血管病的神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病。我國(guó)癲癇的患病率高,約為3.6‰-4.4‰,以16歲以下的兒童和青少年居多。20%-30%癲癇患者雖經(jīng)正規(guī)抗癲癇藥物治療2年以上,仍然反復(fù)發(fā)作得不到控制,成為難治性癲癇(intractable/refractory epilepsy)[1]。兒童期是大腦功能迅速發(fā)育成熟的重要階段,難治
2、性癲癇治療效果差,嚴(yán)重危害著兒童的身心健康。因此,開(kāi)展兒童難治性癲癇的治療方面的研究,探索治療新靶點(diǎn),具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。
生酮飲食(ketogenic diet,KD)是一種高脂肪、低碳水化合物飲食方案,得名源于模擬禁食狀態(tài)下形成酮癥而產(chǎn)生酮體這一代謝過(guò)程,是目前治療兒童難治性癲癇的重要方法之一[2]。1921年Wilder首次用KD臨床治療癲癇并顯示了相對(duì)較好的療效。大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了KD能夠有效控制癲
3、癇的發(fā)作,特別是針對(duì)兒童難治性癲癇的治療,副作用小且療效確切。臨床隨機(jī)調(diào)查發(fā)現(xiàn):進(jìn)行KD療法3個(gè)月,75%的兒童癲癇發(fā)作減少[3-5]。關(guān)于生酮飲食的抗癇機(jī)制尚未完全闡明,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究提示可能與酮體的神經(jīng)保護(hù)作用密切相關(guān)。但是,目前關(guān)于酮體神經(jīng)保護(hù)的具體調(diào)控機(jī)制如何,尚不完全清楚。
本課題分為兩部分:一、通過(guò)HT22海馬細(xì)胞系的培養(yǎng),建立谷氨酸損傷HT22細(xì)胞模型并研究酮體的主要成分β-羥丁酸對(duì)谷氨酸損傷HT22細(xì)胞的神經(jīng)
4、保護(hù)作用。二、在氧化還原水平及細(xì)胞信號(hào)通路水平探討β-羥丁酸神經(jīng)保護(hù)作用的調(diào)節(jié)機(jī)制。
第一部分β-羥丁酸對(duì)谷氨酸損傷HT22細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用
目的:難治性癲癇仍然是臨床治療的重要且棘手的問(wèn)題,難治性癲癇的患者可以選用高脂肪、低碳水化合物的生酮飲食(ketogenic diet,KD)予以治療。近年來(lái),生酮飲食在兒童難治性癲癇的治療中取得了良好的效果,進(jìn)行生酮飲食治療時(shí)脂肪代替碳水化合物成為機(jī)體主要的能量來(lái)源,脂肪
5、在肝臟氧化產(chǎn)生大量乙酰輔酶A(CoA),超過(guò)三羧酸循環(huán)能力,在肝臟線(xiàn)粒體內(nèi)大量合成β-羥丁酸(β-hydroxybutyrate,BHB)、乙酰乙酸(acetoacetate,ACA)、丙酮三種酮體。低碳水化合物飲食情況下,機(jī)體能量主要來(lái)自酮體。大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,KD治療難治性癲癇能夠顯著提高血清和尿液中酮體β-羥丁酸的含量[6],提示β-羥丁酸可能在其抗癇機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但具體機(jī)制尚不明確。本課題占酮體總量78%的β-羥
6、丁酸為切入點(diǎn),利用體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),通過(guò)建立谷氨酸損傷HT22細(xì)胞模型,分析β-羥丁酸的神經(jīng)保護(hù)功能,來(lái)探討β-羥丁酸的抗癇機(jī)制。
方法:體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞,5mM谷氨酸(glutamate,GLU)處理HT22細(xì)胞24小時(shí),建立神經(jīng)細(xì)胞損傷模型,用MTT法檢測(cè)不同濃度BHB預(yù)處理24小時(shí)對(duì)HT22細(xì)胞存活率的影響,以及不同濃度BHB預(yù)處理對(duì)谷氨酸損傷HT22細(xì)胞存活率的影響,倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài),
7、Hoechst33258染色熒光顯微鏡觀察不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞損傷情況。
結(jié)果:
1、分別用2mM,4mM,8mM,10mM四種濃度的BHB預(yù)處理HT22細(xì)胞24小時(shí),MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率,與正常對(duì)照組及組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2、MTT法檢測(cè)5mM的GLU處理組HT22細(xì)胞存活率降低明顯,與正常對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);4mM的BHB預(yù)處理組細(xì)胞的存活率比GLU組高,與GL
8、U組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而8mM的BHB預(yù)處理組細(xì)胞的存活率比GLU組高,但與GLU組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
3、倒置相差顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察顯示:正常對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,細(xì)胞密度較大,數(shù)量多,細(xì)胞及細(xì)胞器完整,細(xì)胞核清晰:GLU組HT22細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡狀態(tài),細(xì)胞密度低,數(shù)量少,細(xì)胞胞體皺縮,胞漿空泡多,核固縮,破碎,胞體及神經(jīng)細(xì)胞突起斷裂、破碎,可見(jiàn)凋亡小體;BHB預(yù)處理組細(xì)胞密度較GL
9、U組大,數(shù)量較GLU組多,可見(jiàn)部分胞體腫脹,部分胞體皺縮,部分細(xì)胞細(xì)胞核固縮,凋亡小體較GLU組少見(jiàn)。
Hoechst33258染色熒光顯微鏡下觀察顯示:正常對(duì)照組的細(xì)胞核為均勻的藍(lán)色,密度大,數(shù)量多,細(xì)胞核清晰均質(zhì),顏色較暗;GLU組細(xì)胞核多為明亮的藍(lán)色,稀疏,數(shù)量少,部分發(fā)白色光,核收縮,趨邊,破碎;BHB預(yù)處理組細(xì)胞核多呈藍(lán)色,密度較GLU組高,數(shù)量較GLU組多,部分為較明亮的藍(lán)色,少數(shù)發(fā)白色光,可見(jiàn)少量核固縮,趨邊。<
10、br> 結(jié)論:
1、2-10mMBHB處理對(duì)HT22細(xì)胞存活率沒(méi)有影響,沒(méi)有神經(jīng)細(xì)胞毒性;
2、GLU對(duì)HT22細(xì)胞具有損傷作用;
3、BHB對(duì)GLU損傷的HT22細(xì)胞具有保護(hù)作用,BHB可能通過(guò)其神經(jīng)保護(hù)作用在生酮飲食抗癲癇中發(fā)揮作用。
第二部分β-羥丁酸神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的相關(guān)研究
目的:神經(jīng)損傷是難治性癲癇發(fā)生的重要機(jī)制,生酮飲食抗癲癇的機(jī)制尚不明確,我們推斷與酮體有關(guān)。我們第一部
11、分研究發(fā)現(xiàn)BHB具有神經(jīng)保護(hù)作用,但是具體調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。一些動(dòng)物研究表明,在低血糖的動(dòng)物模型和帕金森的動(dòng)物模型中,BHB可能在氧化還原水平發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用[7,8]。通過(guò)前面的實(shí)驗(yàn)我們得知BHB對(duì)GLU誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用,β-羥丁酸是否參與調(diào)節(jié)氧化損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷、凋亡,調(diào)控機(jī)制如何,本部分?jǐn)M采用GLU神經(jīng)細(xì)胞損傷模型,從氧化還原水平,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面進(jìn)一步研究β-羥丁酸的神經(jīng)保護(hù)相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制,
12、從而深入了解KD的抗癲癇治療機(jī)制,為臨床提供科學(xué)依據(jù),并為優(yōu)化治療策略提供線(xiàn)索和方向。
方法:DCHF熒光探針檢測(cè)各組HT22細(xì)胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平;比色法檢測(cè)各組丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,Western blot檢測(cè)各組MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中P38MAPK與JNK通路蛋白表達(dá)水平。
結(jié)果:
1、DCHF熒光探針檢測(cè)各組活性氧RO
13、S產(chǎn)生情況,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):正常對(duì)照組(Control組),視野暗,隱約可見(jiàn)暗綠色的細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞胞體完整,細(xì)胞膜連續(xù);5mMGLU處理HT22細(xì)胞24小時(shí)組(GLU組),視野內(nèi)可見(jiàn)較明亮的發(fā)綠色熒光的細(xì)胞胞體,部分細(xì)胞膜破碎,胞突斷裂;4mMBHB預(yù)處理12小時(shí)后,5mMGLU損傷24小時(shí)組(BHB+GLU組),視野較暗,可見(jiàn)發(fā)暗綠色或者綠色熒光的胞體,少數(shù)發(fā)較明亮的綠色熒光;對(duì)相對(duì)熒光量水平進(jìn)行量化分析發(fā)現(xiàn):與正常對(duì)
14、照組Control組相比,GLU組細(xì)胞ROS表達(dá)明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與GLU組相比,BHB+GLU組細(xì)胞ROS表達(dá)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2、各組丙二醛MDA含量的檢測(cè)結(jié)果顯示:
1) Control組為正常對(duì)照組,GLU組為5mMGLU損傷12小時(shí)組,BHB+GLU組為4mMBHB預(yù)處理12小時(shí)后,5mMGLU損傷12小時(shí)組:
GLU組MDA含量最高,與Con
15、trol組相比,MDA含量明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);BHB+GLU組與GLU組相比,MDA含量明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
2) Control組為正常對(duì)照組,GLU組為5mMGLU損傷24小時(shí)組,BHB+GLU組為4mMBHB預(yù)處理12小時(shí)后,5mMGLU損傷24小時(shí)組:
GLU組MDA含量最高,與Control組相比,MDA含量明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);B
16、HB+GLU組與GLU組相比,MDA含量明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
3、Wetern blot檢測(cè)各組P38和JNK的表達(dá)及磷酸化水平發(fā)現(xiàn):
Control組為正常對(duì)照組,GLU組為5mMGLU損傷組,BHB+GLU組為4mMBHB預(yù)處理12小時(shí)后,5mMGLU損傷組:GLU組P38磷酸化水平最高,與正常對(duì)照組Control組相比,磷酸化的P38水平明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),B
17、HB+GLU組與GLU組相比,磷酸化的P38水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);JNK表達(dá)及磷酸化水平趨勢(shì)與P38一致。
結(jié)論:
1、BHB抑制GLU誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞活性氧ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的產(chǎn)生,從而在氧化還原水平起到保護(hù)作用;
2、GLU通過(guò)升高M(jìn)APK通路中P38與JNK的磷酸化水平,通過(guò)激活P38與JNK通路發(fā)揮其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷;
3、BHB降低MAPK通路中P38與
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