IL-6通過JAK2-STAT3信號通路誘導(dǎo)人腹膜間皮細胞(HPMCs)間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)的作用研究.pdf

1、背景與目的：
　　由于腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)具有價格較低、操作簡單方便、對患者生活方式影響少、對血流動力學(xué)影響小、交叉感染率低、可以更好的保護殘余腎功能等優(yōu)點，已成為越來越多ESRD患者首選的RRT方式。隨著PD廣泛應(yīng)用和相關(guān)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)隨著患者PD時間的延長，腹膜透析液的高滲透壓、低 PH值、葡萄糖降解產(chǎn)物等生物不相容因素及反復(fù)發(fā)作的腹膜炎，將引起腹膜形態(tài)和功能的改變，最終引起腹膜纖維化

2、(Peritoneal fibrosis,PF)，導(dǎo)致超濾衰竭(Ultrafiltration Failure,UFF)的發(fā)生率逐漸增加。
　　在IL-6與腹膜透析相關(guān)的研究中，發(fā)現(xiàn)血漿IL-6的濃度在急性期反應(yīng)時增加，并與血液透析和PD患者的死亡率相關(guān)。由于IL-6在PD透出液中的濃度超過其在血漿中的濃度，表明在PD的過程中，局部的腹膜腔可以產(chǎn)生IL-6。有研究顯示，PD治療第一年就可以觀察到PD患者腹腔和全身炎癥反應(yīng)的增加，且

3、腹腔和全身的炎癥反應(yīng)與IL-6可能是相互關(guān)聯(lián)的，PD透出液中IL-6的濃度與腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運率呈線性增加關(guān)系。IL-6在透出液中的濃聚是腹腔局部炎癥的標志，且在腹膜炎時明顯升高。
　　JAK/STAT信號通路維持人體內(nèi)的多種生理過程，并同時參與多種病理過程，包括細胞的增殖、分化、凋亡，是一種重要的介導(dǎo)細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路。在癌癥疾病的研究中，JAK/STAT信號通路已成為腫瘤治療的靶點，發(fā)現(xiàn)多種人類腫瘤如多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、結(jié)直

4、腸癌、乳腺癌等存在異?；罨癄顟B(tài)的STAT3。EMT是上皮細胞癌進展過程中的重要事件，有研究發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3通路參與調(diào)節(jié)上皮細胞之間的黏附過程，與惡性病變中細胞EMT有關(guān)。IL-6與細胞膜結(jié)合受體結(jié)合，從而激活JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，實現(xiàn)IL-6反應(yīng)基因的誘導(dǎo)表達。
　　本研究的目的在于探討IL-6誘導(dǎo)人腹膜間皮細胞（human peritoneal mesothelial cells，HPMCs）EMT的發(fā)生過程。在

5、不同濃度及不同作用時間的IL-6作用下，采用Western blot檢測JAK2/STAT3信號通路的活化狀態(tài)。使用信號通路抑制劑WP066，阻斷JAK2/STAT3信號通路后，觀察HPMCs細胞的EMT過程是否被阻斷，進一步驗證IL-6通過JAK2/STAT3信號通路誘導(dǎo)HPMCs的EMT過程。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)人腹膜間皮細胞，分為四個實驗組。(I)正常對照組;(II)30 ng/mL IL-6作用組;(III

6、)50 ng/mL IL-6作用組;(IV)100 ng/mL IL-6作用組。培養(yǎng)5天后，使用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照。
　　2.使用50 ng/mL IL-6作用人腹膜間皮細胞24h、48h、72h，MTT檢測細胞增殖，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
　　3.設(shè)定3個實驗組，分別為正常對照組，50 ng/mL IL-6組和100 ng/mL IL-6組，作用24h，熒光定量PCR檢測EMT標記

7、物（上皮表型E-cadherin、纖維表型α-SMA和α-SMA）的mRNA表達變化，Western blot檢測其蛋白的表達變化。
　　4.設(shè)定4個實驗組，分別使用50 ng/mL IL-6作用0h（正常對照組）、24h組、48h組、72h組，熒光定量PCR檢測EMT標記物的mRNA表達變化，Western blot檢測其蛋白的表達變化。
　　5.分組同3，Western blot檢測不同劑量IL-6作用24h，JAK2/

8、STAT3信號通路蛋白的活化狀態(tài)。
　　6.分組同4，Western blot檢測50 ng/mL IL-6作用不同時間，JAK2/STAT3信號通路蛋白的活化狀態(tài)。
　　7.分別設(shè)定0（正常對照組）,2,4,6,8 and10μM濃度的WP1066，作用時間持續(xù)24h，Western blot方法檢測各組 P-STAT3/STAT3的相對水平，得出WP1066的有效作用濃度。
　　8.使用WP1066阻斷JAK2/S

9、TAT3信號通路，Western blot方法檢測P-JAK2、JAK2、P-STAT3及STAT3的表達變化。
　　9.使用WP1066阻斷JAK2/STAT3信號通路，熒光定量PCR檢測EMT標記物的mRNA表達變化，Western blot檢測其蛋白的表達變化。
　　10.使用WP1066阻斷JAK2/STAT3信號通路，倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)變化，MTT法檢測細胞增殖變化。
　　結(jié)果
　　1.使用

10、中濃度(50ng/ml)及高濃度(100ng/ml)的IL-6外源性刺激HPMCs5天，發(fā)現(xiàn)細胞由多角形、鵝卵石樣的上皮樣細胞形態(tài)向梭形、扁平星樣的纖維樣細胞形態(tài)改變，同時細胞間隙增寬、連接疏松，呈明顯纖維樣改變。
　　2.在MTT實驗中，外源性使用50ng/ml的IL-6分別作用HPMCs24、48、72h，發(fā)現(xiàn)與同時間空白對照組相比，IL-6能夠明顯刺激HPMCs細胞增殖。
　　3.隨著IL-6作用濃度的增高，細胞上皮表

11、型E-cadherin蛋白和mRNA表達水平逐漸下降，纖維表型α-SMA和VEGF蛋白及mRNA表達水平逐漸增高，實驗組與正常對照組相比，表達水平有統(tǒng)計學(xué)差異（＊P<0.05）。
　　4.使用50ng/ml IL-6作用HPMCs不同時間（24、48、72h），發(fā)現(xiàn)隨著作用時間的延長，E-cadherin蛋白及和mRNA表達水平逐漸降低，相反的，上皮表型蛋白α-SMA和VEGF蛋白及和mRNA表達水平逐漸增高，與正常對照組相比，其

12、差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＊P<0.05）。
　　5.作用時間24h，隨著IL-6作用濃度的增高，磷酸化的JAK2和磷酸化的STAT3表達水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＊P<0.05）。
　　6.IL-6作用濃度50ng/ml，隨著作用時間的延長，磷酸化的JAK2和磷酸化的STAT3表達水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＊P<0.05）。
　　7.Western blot結(jié)果顯示,當WP1066的濃度為10μM時，與正常對照組

13、相比，P-STAT3表達明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＊P<0.05）。
　　8.使用WP1066阻斷JAK2/STAT3信號通路，磷酸化的JAK2和磷酸化的STAT3表達水平較正常對照組無明顯變化，WP1066可阻斷IL-6誘導(dǎo)的JAK2/STAT3通路活化狀態(tài)。
　　9.阻斷HPMCs細胞中JAK2/STAT3通路活化后，上皮表型E-cadherin蛋白和mRNA表達水平，纖維表型α-SMA和VEGF蛋白和mRNA表達水平

14、，未發(fā)生明顯變化，與正常對照組及抑制劑對照組相比，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　10.阻斷HPMCs細胞中JAK2/STAT3通路活化后，細胞形態(tài)仍然呈多角形、鵝卵石樣，不再呈纖維樣改變。MTT檢測細胞增殖，發(fā)現(xiàn)IL-6誘導(dǎo)的細胞增殖被減弱。
　　結(jié)論：
　　1.IL-6可誘導(dǎo)HPMCs發(fā)生EMT，其標記物的表達對IL-6有劑量依賴性和時間依賴性。
　　2.JAK2/STAT3信號通路的活化對IL-6有劑量依賴性和時間