體外抑制腫瘤JAK-STAT通路探討STAT1和STAT4對(duì)腫瘤免疫的影響.pdf

1、目的；探討腫瘤細(xì)胞中STAT1和STAT4的表達(dá)對(duì)T細(xì)胞活化的作用。通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞中STAT1和STAT4的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的被引導(dǎo)情況，并進(jìn)一步觀察在此過(guò)程中腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TGF-β2和IL-10mRNA表達(dá)對(duì)引導(dǎo)結(jié)果的影響。 方法 1、選取兩個(gè)STAT1和STAT4的表達(dá)活躍的小鼠腫瘤細(xì)胞系：Mosec(MouseOvarianSurfaceEpithelialCell，小鼠卵

2、巢上皮癌細(xì)胞)和Tc-1細(xì)胞系(TissueCulturenumberone，小鼠肺上皮癌細(xì)胞)，采用兩種不同的方法：(1)氟達(dá)拉濱(Fludarabine，STAT1特異性抑制劑)藥物治療和(2)RNA干擾技術(shù)，對(duì)STAT1和STAT4的表達(dá)予以干預(yù)。 2、用免疫組化的方法觀察藥物治療和RNA干擾技術(shù)處理前后細(xì)胞系的STAT1和STAT4的蛋白表達(dá)差異，并采用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)藥物治療和RNA干擾技術(shù)處理前后細(xì)胞系的

3、STAT1和STAT4的mRNA表達(dá)量的不同，以明確干預(yù)方法的有效性。 3、將STAT1和STAT4蛋白被抑制的腫瘤細(xì)胞及其上清液分別與小鼠新鮮脾細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)后T細(xì)胞中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例。 4、用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)被抑制STAT1和STAT4的細(xì)胞的TGF-β2和IL-10的mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果 1、免疫組化和RT-PCR結(jié)果顯示采用fludarab

4、ine藥物治療和RNA干擾的方法能夠成功的降低細(xì)胞STAT1和STAT4的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)； 2、流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)結(jié)果顯示： (1)腫瘤細(xì)胞上清液與脾細(xì)胞共培養(yǎng)，抑制腫瘤細(xì)胞STAT1后與對(duì)照組比較T細(xì)胞中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例無(wú)明顯變化；抑制腫瘤細(xì)胞STAT4后與對(duì)照組比較CD4+CD25+Treg細(xì)胞在T細(xì)胞中的比例呈2倍明顯增高； (2)腫瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞共培養(yǎng)，抑制STAT1和STAT4與

5、對(duì)照組相比無(wú)顯著變化。 3、RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)結(jié)果顯示： (1)腫瘤細(xì)胞不表達(dá)或微表達(dá)IL-10，抑制STAT4后細(xì)胞IL-10表達(dá)明顯增加，抑制STAT1后細(xì)胞仍不表達(dá)或微表達(dá)IL-10； (2)腫瘤細(xì)胞表達(dá)TGF-β2，抑制STAT4后細(xì)胞TGF-β2表達(dá)無(wú)明顯變化。 結(jié)論；與對(duì)照組相比，干預(yù)STAT4后的腫瘤細(xì)胞通過(guò)上清液作用可引導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例明顯增加。