DTD在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)譜分析與功能的初步研究.pdf

1、氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。生物體內(nèi)存在L構(gòu)象和D構(gòu)象兩種形式的氨基酸。L構(gòu)象的氨基酸是合成天然蛋白質(zhì)的主要原料。D構(gòu)象氨基酸在體內(nèi)參與多種生理功能，尤其是在高等動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中，存在高濃度的D型絲氨酸和D型天冬氨酸。D型絲氨酸作為神經(jīng)系統(tǒng)中起著多種重要功能的NMDA受體的生理配基，起著非常重要的作用。而D型天冬氨酸在神經(jīng)系統(tǒng)中起到神經(jīng)遞質(zhì)的作用，介導(dǎo)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞間的對(duì)話(huà)。但D型氨基酸參與到蛋白質(zhì)合成中會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，為了

2、防止這種錯(cuò)誤的產(chǎn)生，在細(xì)菌、真菌和高等動(dòng)物中都發(fā)現(xiàn)存在D—酪氨酰-TRNA脫酰酶(D-Tyr-TRNATyr Deacylase，DTD)，DTD能夠水解錯(cuò)誤生成的D—氨?；痶RNA，進(jìn)而確保蛋白質(zhì)合成高效正確的進(jìn)行。 氨酰tRNA合成酶同DTD一樣具有tRNA編校功能，近期對(duì)其敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，RNA編校結(jié)構(gòu)域的缺失會(huì)使小鼠出現(xiàn)典型的神經(jīng)退行性病變表型。神經(jīng)系統(tǒng)處于高濃度D型氨基酸的環(huán)境中，神經(jīng)元必須擁有嚴(yán)格的氨?；瘶?gòu)象選擇

3、性，才能保證蛋白質(zhì)的正確合成，進(jìn)而保證細(xì)胞機(jī)能的正常穩(wěn)定。 蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能往往與其時(shí)空定位密切相關(guān)，為了更好的開(kāi)展DTD在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中的功能研究，我們首先對(duì)DTD在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中的時(shí)空定位進(jìn)行檢測(cè)。蛋白印記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DTD在小鼠腦組織中的表達(dá)高于其它被測(cè)組織，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示DTD在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中特異表達(dá)，而在膠質(zhì)細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)。利用原位雜交技術(shù)對(duì)DTD在小鼠不同發(fā)育時(shí)期E12.5、E14.5、E16.5、P

4、0、P3和成年小鼠腦組織表達(dá)譜的研究表明，DTD在上述時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá)，并且主要定位在皮層的錐體神經(jīng)元、海馬的錐體神經(jīng)元、小腦蒲肯野細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)元。 通過(guò)定位研究我們發(fā)現(xiàn)DTD在小鼠海馬組織中高表達(dá)。海馬組織是腦中負(fù)責(zé)存儲(chǔ)信息的關(guān)鍵部位，與學(xué)習(xí)和記憶等生理功能密切相關(guān)。同時(shí)臨床觀察和研究報(bào)道，學(xué)習(xí)與記憶功能的異常是神經(jīng)退行性疾病的主要表現(xiàn)之一。因此我們推測(cè)DTD的表達(dá)異常可能與神經(jīng)退行性疾病具有一定聯(lián)系。SAM品系小鼠是研究

5、老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病較為經(jīng)典的模型，本研究選擇其作為模式動(dòng)物。SAM品系小鼠包括快速老化小鼠SAMP8和正常對(duì)照組小鼠SAMR1兩種。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平，4月齡、8月齡SAMP8小鼠海馬組織中DTD的表達(dá)量低于同月齡SAMR1小鼠。為了對(duì)DTD的功能進(jìn)行進(jìn)一步研究，我們利用Ni柱親和層析，凝膠過(guò)濾層析等方法對(duì)DTD蛋白進(jìn)行純化，得到高純度的DTD蛋白。之后利用腦立體定位注射技術(shù)，將DTD蛋白注射回8月齡SAM品系小鼠

6、側(cè)腦室中，使用避暗實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，觀察補(bǔ)充外源DTD蛋白對(duì)SAMP8小鼠行為學(xué)的影響。 基因敲除技術(shù)是目前研究特定基因功能最為直接有效的實(shí)驗(yàn)手段。通過(guò)對(duì)DTD在正常小鼠腦組織中的定位研究和在SAM品系小鼠中的初步功能研究，我們推測(cè)DTD可能在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能。為了更加深入的研究DTD的功能，我們從美國(guó)Sanger公司購(gòu)得兩株DTD基因敲除ES細(xì)胞系(CA0301，CJ0522)進(jìn)行DTD基因敲除小鼠構(gòu)建工作，現(xiàn)已得到嵌