神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的膜蛋白NECL2的功能研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的膜蛋白NECL2的功能研究姓名：胡曉燕申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：袁建剛;強(qiáng)伯勤2002.6.1—_ - ，·’_ _ _ _ _ 。_ 。_ _ _ _ _ 。- 。。。。。。。。。。。。?！?。。?！?。?！?。。。‘。。?！?。。。。。。。?！篛 a 中田醫(yī)學(xué)科學(xué)院博l 畢業(yè)論文有三個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，單一跨膜區(qū)和一短的胞內(nèi)區(qū)

2、。N E C L 2 在多種組織中廣泛表達(dá)。人多組織R N A 斑點(diǎn)雜交表明人N E C L 2 表達(dá)廣泛，在成人小腦、大腦皮層、丘腦、下丘腦、垂體、睪丸、甲狀腺及胎盤表達(dá)較高：在} { O I L 腦、肝臟與肺中表達(dá)較高。小鼠的多組織N o r t h e r n 雜交顯示小鼠N e c l 2 在心、腦、肺、肝、骨骼肌與睪丸皆有表達(dá)，睪丸表達(dá)量較高，而脾與腎表達(dá)量低。除骨骼肌為3 k b 左右轉(zhuǎn)錄本外．在其余組織皆有1 ．8 k b

3、 及4 ．5 k b 兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，在腦中以4 ．5 k b轉(zhuǎn)錄本為主，這與H i r o k i g o m y o 等對人N E C L 2 的N o r t h e r n 雜交結(jié)果相符。為研究N E C L 2 蛋白在組織中的分布，我們制備了N E C L 2 的單克隆抗體和多克隆抗體。W e s t e r n 雜交顯示在小鼠腦組織中有一4 8 K D a 左右的單一條帶。對成年小鼠腦與脊髓的冠狀切片與矢狀切片行組織原位雜交和免

4、疫組織化學(xué)分析，結(jié)果顯示N E C L 2 蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的定位與m R N A 一致：在海馬、齒狀回、小腦蒲肯野細(xì)胞層及腦橋某些核團(tuán)如面神經(jīng)核的神經(jīng)元中高表達(dá)：某些膠質(zhì)細(xì)胞可能也有表達(dá)；在脊髓前角高表達(dá)，而后角未見表達(dá)。為了進(jìn)一步尋找N E C L 2 蛋白的功能信息，我們分析了N E C L 2 與蛋白4 ．1 家族和M A G U K 家族成員的相互作用。我們將編碼4 ．1 N 、4 ．1 R 、4 ．1 G 和4 ．1 B3

5、 0 k D a 膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域和h d l g 的P D Z l - 2 、P D Z I ．3 結(jié)構(gòu)域的e D N A 片段按正確讀碼框克隆g t J p G E X ．- 4 T —l 原核表達(dá)載體中行原核表達(dá)并用親核層析的方法得到了純化蛋白。用I A s y s 檢測蛋白之間的相互作用，結(jié)果顯示N E C L 2 蛋白與蛋白4 ．1 和h d l g 的P D Z l ．3 結(jié)構(gòu)域之間存在相互作用。為尋找N E C L 2 新的胞

6、內(nèi)相互作用蛋白，我們以心2 胞內(nèi)區(qū)為誘餌，篩選人胎腦庫，結(jié)果得到一個(gè)編碼C L A R P ( e a s p a s e l i k ea p o p t o s i s r e g u l a t o r y p r o t e i n ) 的e D N A 片段。二者之間的相互作用還需用其它方法進(jìn)一步證實(shí)。蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位可以提供重要的功能信息，因此我們利用黃色熒光載體p E Y F P - N I 將N E C L 2 導(dǎo)入人

7、膠質(zhì)細(xì)胞瘤來源的B T 3 2 5 細(xì)胞中，觀察N E C L 2 在真核細(xì)胞中的定位情況。結(jié)果表明N E C L 2 的確編碼一細(xì)胞膜蛋白。細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)對于研究一個(gè)新基因的功能是必不可少的。我們用N E C L 2c D N A 轉(zhuǎn)染不同的細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)N E C L 2 可誘導(dǎo)N B 4 細(xì)胞發(fā)生凋亡，引起S H S Y 5 Y 細(xì)胞的壞死，而對I ．} 2 5 1 細(xì)胞、B T 3 2 5 細(xì)胞和C o s 7 細(xì)胞沒有明顯影