幾種信鴿新型病原分析與感染模型研究.pdf

1、信鴿與人類接觸密切，信鴿飼養(yǎng)在我國(guó)有著悠久的歷史和廣泛的群眾基礎(chǔ)，并主要集中在大中城市等人口密集地區(qū)。信鴿攜帶疫病存在公共衛(wèi)生安全風(fēng)險(xiǎn)。本課題圍繞幾種信鴿重要新型病原體，從病原宏基因組學(xué)研究、新型圓環(huán)病毒全基因組序列分析、出血性大腸桿菌活體成像模型、新型多重耐藥海豚葡萄球菌分離鑒定等方面開(kāi)展了系統(tǒng)研究。
　　病原宏基因組學(xué)研究在本研究中利用以二代測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的宏基因組學(xué)研究方法，對(duì)長(zhǎng)春地區(qū)2015年3月到2016年1月間采集的信

2、鴿與野化家鴿樣本進(jìn)行了病原篩查研究。共采集信鴿肛咽拭子1375份，血清樣本157分，健康信鴿78只，病鴿及病死信鴿610余只，野化家鴿35只。樣品采集地點(diǎn)包括長(zhǎng)春市的綠園、二道、凈月、寬城、九臺(tái)、新立城鎮(zhèn)和范家屯鎮(zhèn)等地區(qū)。上述樣本經(jīng)過(guò)宏基因組學(xué)前期建庫(kù)、測(cè)序及序列拼接后一共得到8,774,818個(gè)讀長(zhǎng)(reads)，總共251,328,000個(gè)堿基(nt)，經(jīng)過(guò)拼接得到8,054,530個(gè)重疊序列，能拼接的序列占總序列的91.79％，O

3、verlap Reads平均長(zhǎng)度為181 nt。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，有32.956％的序列注釋到了真菌，16.136％的序列注釋到了細(xì)菌、2.201％的序列注釋到了病毒、余下48.707％的為未知序列。其中病毒可以進(jìn)一步分成22個(gè)科和兩個(gè)亞科，37個(gè)屬，9個(gè)科11個(gè)屬的病毒。與禽類相關(guān)的病毒主要包括有：A型輪狀病毒、鴿圓環(huán)病毒、海鷗圓環(huán)病毒、燕八哥圓環(huán)病毒、雞圓環(huán)病毒、痘病毒、鴨乙型肝炎病毒。通過(guò)對(duì)比信鴿與野化家鴿的病毒組，發(fā)現(xiàn)兩種不同種類

4、的鴿子所攜帶的病毒種類存在較大的差異。A型輪狀病毒在四組信鴿樣品中均有出現(xiàn)，野化家鴿（feral pigeon）沒(méi)有reads注釋到輪狀病毒。腺聯(lián)病毒、禽冠狀病毒、腸道病毒B、禽白血病病毒、鴿細(xì)小病毒等病毒序列則只出現(xiàn)在野化家鴿樣品中。只有鴿圓環(huán)病毒（columbid circovirus）同時(shí)出現(xiàn)在信鴿與野化家鴿樣品中。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)圓環(huán)病毒和輪狀病毒為長(zhǎng)春地區(qū)信鴿感染的主要病原。通過(guò)對(duì)比不同分組信鴿圓環(huán)病毒reads注釋情況，發(fā)現(xiàn)YPDS

5、鴿樣品的PiCV序列數(shù)量和豐富度均高于健康鴿。
　　新型圓環(huán)病毒全基因組序列分析。根據(jù)宏基因組測(cè)序的 reads，選取了圓環(huán)病毒、輪狀病毒進(jìn)行進(jìn)一步的深度分析。針對(duì)宏基因組測(cè)序得到的reads設(shè)計(jì)引物，獲得了兩株信鴿 PiCV的基因組全序列。分析發(fā)現(xiàn)兩株吉林PiCV處在一個(gè)進(jìn)化分支，與來(lái)自歐美的6株鴿圓環(huán)病毒與1株雞圓環(huán)病毒共處在一個(gè)大的分支。而中國(guó)的鴿圓環(huán)病毒浙江株和福建株則處在另一個(gè)大的分支上，因此可以懷疑，這兩株信鴿圓環(huán)病毒

6、很可能是隨著信鴿進(jìn)口貿(mào)易一并引進(jìn)的外來(lái)病原。本實(shí)驗(yàn)成功的分離鑒定到一株信鴿輪狀病毒，通過(guò)與9株已報(bào)道的輪狀病毒部分VP2基因的對(duì)比和遺傳進(jìn)化分析，最后發(fā)現(xiàn)該毒株與北京地區(qū)環(huán)頸斑鳩的輪狀病毒關(guān)系最近，而與其他鴿源輪狀病毒關(guān)系較遠(yuǎn)，這提示，信鴿和環(huán)頸斑鳩這兩種鳩鴿科的鳥(niǎo)類可以發(fā)生了病毒的交叉?zhèn)鞑ァ?br>　　出血性大腸桿菌活體成像模型在關(guān)注宏基因組測(cè)序結(jié)果中病毒注釋情況的同時(shí)，還對(duì)樣品序列中的細(xì)菌序列做了注釋和分析。發(fā)現(xiàn)注釋到大腸桿菌、葡萄

7、球菌、沙門氏菌和巴氏桿菌的reads數(shù)量很多。為了探究大腸桿菌感染鴿子的過(guò)程，構(gòu)建了發(fā)光大腸桿菌感染鴿子的生物發(fā)光活體成像模型。通過(guò)腹腔注射感染幼齡信鴿，通過(guò)生物發(fā)光信號(hào)來(lái)觀察細(xì)菌在信鴿體內(nèi)的定殖和擴(kuò)散形況。在該實(shí)驗(yàn)中成功觀察到了生物發(fā)光大腸桿菌通過(guò)鴿消化道上行感染并引起幼鴿嘔吐的整個(gè)過(guò)程，并且在有嘔吐癥狀幼鴿的嗉囊和嘔吐物中檢測(cè)到了生物發(fā)光信號(hào)，而嘔吐恰也是目前在賽鴿中廣泛流行的幼鴿疾病綜合癥（YPDS）的典型癥狀之一。
　　新

8、型多重耐藥海豚葡萄球菌分離鑒定在樣本收集的過(guò)程中，還對(duì)部分有特征性病癥的信鴿進(jìn)行了致病菌的分離。在眾多的細(xì)菌分離株中，選取了一株具有多重耐藥性的葡萄球菌進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生化特性與耐藥性分析、Partial kat(Catalase)基因與16S rRNA基因序列分析，確定該菌為凝固酶陽(yáng)性、β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性海豚葡萄球菌，該菌具有多重耐藥特性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該菌株可以引起幼鴿的肺炎和眼部炎癥。該菌株的16S rRNA基

9、因與土耳其家鴿分離株（HQ452509.1）16S rRNA基因的核苷酸同源性最高，為100%。而Partial kat(Catalase)基因則與俄羅斯家鴿源海豚葡萄球菌（KU641399.1）的同源性最高，為99%。然而該菌具有其它家鴿分離株所不具備的多種抗生素的耐藥性，該病菌對(duì)氨芐西林、青霉素G、復(fù)方磺胺惡唑、甲氧芐氨嘧啶、克林霉素、紅霉素、達(dá)福普丁、環(huán)丙沙星、四環(huán)素均耐藥，對(duì)阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、頭孢西丁、苯唑西林、替考

10、拉寧、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、莫匹羅星、利福平敏感。
　　綜上所述，本研究利用宏基因組學(xué)方法和生物發(fā)光模型等新技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)的病原分離鑒定手段，針對(duì)長(zhǎng)春地區(qū)信鴿新型病原進(jìn)行了系統(tǒng)研究。成功獲得了兩株圓環(huán)病毒的全基因組序列，鑒定分離一株信鴿源A型輪狀病毒和一株多重耐藥的海豚葡萄球菌；對(duì)上述幾株新型病原的分離鑒定研究工作將在一定程度上彌補(bǔ)了國(guó)內(nèi)信鴿疫病研究的不足，為今后信鴿疫病的防控提供了參考。成功建立出血性大腸桿菌活體成像模型，感染模型