骨化三醇對缺氧腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其抗腎纖維化機(jī)制的研究.pdf

1、目的:通過觀察骨化三醇對缺氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞(Humankedneyproxiamal tubular cells-2，HK-2)的影響，探討骨化三醇對腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其通過腎小管上皮細(xì)胞途徑改善腎纖維化的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1人腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng):人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)，在37℃、5％CO2、飽和濕度下用含10％胎牛血清的DMEM/F121∶1培養(yǎng)基培養(yǎng)。將HK-2細(xì)胞分為5組:①空白對照組

2、;②氯化鈷刺激組;③氯化鈷+10-10mol/L骨化三醇高劑量組;④氯化鈷+10-11mol/L骨化三醇中劑量組;⑤氯化鈷+10-12mol/L骨化三醇低劑量組。
　　2采用MTT法觀察骨化三醇對氯化鈷刺激人腎小管上皮細(xì)胞增殖能力的影響。
　　3采用Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)分析骨化三醇對各實驗組人腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的影響。
　　4采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immnosorben

3、t assay，ELISA)檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF、MCP-1、TGF-β的含量。
　　5采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)檢測各組細(xì)胞VEGF、MCP-1、ICAM-1 mRNA的表達(dá)水平。
　　6采用免疫印跡(Western Blot)法檢測各組ICAM-1蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1骨化三醇

4、對經(jīng)氯化鈷誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞增殖的影響
　　低氧可明顯抑制HK-2細(xì)胞增殖，細(xì)胞培養(yǎng)液中骨化三醇的終濃度為10-11mol/L時，HK-2細(xì)胞增殖最明顯，與氯化鈷刺激組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2骨化三醇對經(jīng)氯化鈷誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響
　　氯化鈷刺激組細(xì)胞凋亡率明顯升高，與空白對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。經(jīng)不同劑量骨化三醇作用24h后，各組HK-2細(xì)胞凋亡率顯著下降，與氯化鈷刺

5、激組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05），骨化三醇低劑量組與高中劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3骨化三醇對經(jīng)氯化鈷誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞VEGF、MCP-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響
　　氯化鈷刺激組MCP-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)較空白對照組顯著升高（P＜0.05），而VEGF mRNA表達(dá)較空白對照組相比升高不明顯(P＞0.05)。經(jīng)骨化三醇作用24h之后，與氯化鈷刺激組相比，HK-2細(xì)胞MCP-

6、1、ICAM-1mRNA的表達(dá)明顯抑制（P＜0.05），而VEGFmRNA的表達(dá)顯著升高(P＜0.05）?？瞻讓φ战M中VEGF、MCP-1、ICAM-1mRNA均有基礎(chǔ)量表達(dá)。
　　4骨化三醇對經(jīng)氯化鈷誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞上清液中VEGF、TGF-β、MCP-1含量影響
　　氯化鈷刺激組MCP-1、TGF-β的含量較空白對照組升高(P＜0.05），而VEGF與空白對照組升高不明顯（P＞0.05）。經(jīng)骨化三醇作用24h后，HK-

7、2細(xì)胞MCP-1、TGF-β的表達(dá)水平降低，與氯化鈷刺激組相比(P＜0.05)。HK-2細(xì)胞VEGF的含量升高，與氯化鈷刺激組相比(P＜0.05)?？瞻讓φ战M中VEGF、MCP-1、TGF-β均有基礎(chǔ)量水平表達(dá)。
　　5骨化三醇影響氯化鈷誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ICAM-1的蛋白表達(dá)氯化鈷刺激組ICAM-1蛋白與空白組相比明顯升高（P＜0.05），經(jīng)骨化三醇作用24h后與氯化鈷刺激組相比ICAM-1蛋白明顯下降（P＜0.05），以10-

8、11mol/L組最為明顯。
　　結(jié)論:
　　1骨化三醇具有抑制氯化鈷誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞增殖活力下降和凋亡的作用。顯示了骨化三醇對HK-2細(xì)胞的缺氧損傷保護(hù)作用。
　　2骨化三醇可減少氯化鈷誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞趨化因子(MCP-1)、黏附因子(ICAM-1)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)表達(dá)。結(jié)果顯示骨化三醇通過對缺氧狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子和強(qiáng)促纖維化因子的抑制作用及其上