足細(xì)胞分泌的微囊泡對腎小管上皮細(xì)胞作用研究.pdf

1、局灶節(jié)段性腎小球硬化(Focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)是常見的腎小球疾病，其發(fā)病率呈現(xiàn)增加趨勢。FSGS由腎臟病理形態(tài)學(xué)特征來命名，具有發(fā)病機制的復(fù)雜性和我們認(rèn)識的有限性。FSGS臨床上突出表現(xiàn)為大量蛋白尿和足細(xì)胞損傷，而腎小管間質(zhì)損傷也是其突出的特點。既往的觀點認(rèn)為大量蛋白尿?qū)δI小管的損傷、腎小球節(jié)段硬化尤其是血管極硬化性病變至出球小動脈狹窄導(dǎo)致相應(yīng)腎單位缺血性損傷、腎小球節(jié)段病變和包曼

2、囊粘連使尿液返滲至腎間質(zhì)是FSGS腎小管間質(zhì)損傷的原因。然而這些機制不足以完全解釋臨床上觀察到的現(xiàn)象，因此闡明FSGS導(dǎo)致腎小管間質(zhì)損傷的機制對于揭示FSGS的發(fā)生發(fā)展和臨床上尋找治療干預(yù)措施具有重要意義。
　　 除了可溶性因子，細(xì)胞來源的微囊泡(Microvesicles，MV)是一種新的細(xì)胞間信息傳遞介質(zhì)，引起人們廣泛的關(guān)注。體內(nèi)多種細(xì)胞均可釋放微囊泡，包括腎小球足細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞等。微囊泡可以借助自身表面

3、攜帶的粘附分子、受體特異性結(jié)合靶細(xì)胞或?qū)?nèi)容物mRNAs、microRNAs、蛋白及信號分子轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞。研究表明胚胎干細(xì)胞(ESCs)釋放的微囊泡通過mRNA和蛋白的傳遞重新編程造血祖細(xì)胞;人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分泌的微囊泡可以刺激腎小管上皮細(xì)胞的體外增殖和抗凋亡作用;內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)分泌的微囊泡通過microRNAs的傳遞保護缺血再灌注的腎小管上皮細(xì)胞損傷。我們推測，足細(xì)胞在激活或損傷情況下，可能會

4、分泌微囊泡作用于腎小管上皮細(xì)胞，產(chǎn)生損傷作用。
　　 本研究借助人足細(xì)胞系(HPC)、人近端腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2)，研究受損足細(xì)胞分泌的微囊泡對腎小管上皮細(xì)胞的作用。
　　 第一部分:足細(xì)胞分泌微囊泡的鑒定
　　 一、目的:
　　 提取體外培養(yǎng)人足細(xì)胞分泌的微囊泡，然后進行鑒定;人尿液足細(xì)胞分泌微囊泡的鑒定。
　　 二、方法:
　　 1、通過超速離心法分別對體外培養(yǎng)人足細(xì)胞的培養(yǎng)上清

5、和人尿液進行微囊泡的分離。
　　 2、通過電鏡、免疫電鏡觀察微囊泡的超微結(jié)構(gòu)。Western blot驗證微囊泡特異性標(biāo)志物的表達。
　　 三、結(jié)果:
　　 1、電鏡下觀察體外培養(yǎng)人足細(xì)胞微囊泡呈圓形或橢圓形膜性囊泡結(jié)構(gòu)，腔內(nèi)為低電子致密物質(zhì)，平均直徑大小在30～100nm之間。Western blot和免疫電鏡證實微囊泡特異性標(biāo)志物CD63的表達。
　　 2、電鏡下觀察人尿液微囊泡平均直徑大小在40～1

6、50nm，有完整的包膜。Western blot證實足細(xì)胞特異性標(biāo)志物podocalyxin的表達。
　　 四、結(jié)論:
　　 足細(xì)胞可以分泌微囊泡。
　　 第二部分:足細(xì)胞分泌微囊泡對腎小管上皮細(xì)胞的作用
　　 一、目的:
　　 通過觀察受損足細(xì)胞分泌微囊泡對近端腎小管上皮細(xì)胞的β-catenin、E-cadherin、Megalin等基因表達和內(nèi)吞功能的影響，分析足細(xì)胞分泌微囊泡對腎小管上皮細(xì)胞

7、的損傷作用。
　　 二、方法:
　　 1、收集正常和LPS刺激足細(xì)胞分泌的微囊泡，經(jīng)熒光標(biāo)記物(PKH26)標(biāo)記后孵育腎小管上皮細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察是否可以進入到腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)。
　　 2、收集正常和LPS刺激足細(xì)胞分泌的微囊泡，使用不同濃度的微囊泡作用于HK-2細(xì)胞。實時細(xì)胞分析儀監(jiān)測HK-2細(xì)胞活力變化;免疫熒光法分析HK-2的β-catenin和Megalin的表達變化和內(nèi)吞功能的變化;qRT-

8、PCR和Western blot方法檢測β-catenin、E-cadherin等mRNA和蛋白水平變化。
　　 三、結(jié)果:
　　 1、比較損傷刺激足細(xì)胞分泌的微囊泡蛋白水平變化:與正常組相比，LPS刺激組足細(xì)胞分泌的微囊泡蛋白水平升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 2、足細(xì)胞分泌的微囊泡經(jīng)PKH26標(biāo)記后孵育HK-2，熒光顯微鏡觀察HK-2細(xì)胞胞漿內(nèi)充滿大量紅色熒光物質(zhì)。
　　 3、實時細(xì)胞分析儀觀察:與正常

9、HK-2細(xì)胞和正常足細(xì)胞分泌微囊泡刺激HK-2細(xì)胞比較，LPS刺激足細(xì)胞分泌的微囊泡能抑制HK-2細(xì)胞活力，細(xì)胞指數(shù)最低。
　　 4、與正常足細(xì)胞分泌的微囊泡相比，LPS刺激足細(xì)胞分泌的微囊泡處理HK-2細(xì)胞后，免疫熒光結(jié)果顯示HK-2細(xì)胞β-catenin和Megalin表達下降、內(nèi)吞功能下降;western blot結(jié)果顯示HK-2細(xì)胞β-catenin、E-cadherin的蛋白水平下降，qRT-PCR結(jié)果顯示β-cate