熱休克蛋白72抑制腎小管上皮細胞凋亡對腎小管間質(zhì)纖維化的影響.pdf

1、腎小管間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同途徑。其主要病理變化是腎小管上皮細胞丟失、腎小管萎縮，淋巴細胞和單核細胞浸潤、細胞外基質(zhì)增多及間質(zhì)中出現(xiàn)大量肌成纖維細胞。越來越多的證據(jù)顯示，腎小管上皮細胞凋亡對腎小管上皮細胞的丟失導致腎臟萎縮及疾病的進展起著重要作用。但腎小管上皮細胞凋亡對腎間質(zhì)纖維化的影響尚無直接證據(jù)。熱休克蛋白72(HSP72)是一種高度保守的內(nèi)源性、細胞保護性蛋白，在細胞應激時發(fā)揮分子伴侶作用。近年來HSP7

2、2的抗凋亡作用廣泛受到關注。單側輸尿管梗阻模型(UUO)是經(jīng)典的腎小管間質(zhì)纖維化動物模型。已有研究證實，UUO模型中HSP72僅在梗阻側腎表達增高，提示其增高為組織損傷后的一種特異性反應，然而內(nèi)源性的HSP72不足以起到組織損傷時的細胞保護作用。外源性HSP72是否能在腎小管間質(zhì)損傷中發(fā)揮保護作用，目前國內(nèi)外未見報道。本研究擬(1)通過施維舒(geranylgeranylacetone，GGA)誘導大鼠特異性高表達HSP72，探討HSP

3、72對大鼠UUO模型腎小管間質(zhì)纖維化的影響；(2)通過含HSP72基因的腺病毒感染腎小管上皮細胞株，明確腎小管上皮細胞凋亡與轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)的關系并探討HSP72對轉(zhuǎn)分化的影響，從而為腎小管間質(zhì)纖維化的防治提供新的思路和理論依據(jù)。 第一章HSP72對大鼠UUO模型腎小管間質(zhì)纖維化的影響 目的：探討大鼠UUO模型中HSP72對腎小管上皮細胞凋亡及腎小管間質(zhì)纖

4、維化的影響。 方法：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分成3組：假手術組、模型組和GGA處理組。建立模型前1d開始，GGA處理組和模型組分別給予400mg/kgGGA和溶媒(0.05％阿拉伯樹膠+0.008％維生素E)灌胃，每天1次，在模型建立后第3d，7d和14d分別處死大鼠(n=5)。常規(guī)染色觀察腎臟組織病理改變，間接免疫熒光及western-blot檢測細胞緊密連接E-cadherin及肌成纖維細胞標志物α-

5、SMA；免疫組織化學染色檢測促凋亡蛋白Bax及增殖細胞核抗原PCNA的表達；TUNEL染色檢測腎小管上皮凋亡細胞數(shù)；western-blot檢測HSP72及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。 結果：UUO模型組第3d、7d和14d腎小管損害的百分比分別為38.6±0.04、65.8±0.07、81.9±0.04，顯著高于假手術組(P＜0.05)；腎間質(zhì)纖維化分值3d、7d和14d分別為0.38±0.15、1.36±0.59、2.87±

6、0.69，顯著高于假手術組(P＜0.05)，提示大鼠UUO模型的成功建立。免疫組化染色顯示促凋亡蛋白Bax主要位于病變的腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)，與假手術組相比，Bax的表達明顯上調(diào)，Bcl-2下調(diào)，說明大鼠UUO模型中，凋亡信號通路被激活。Western-blot結果顯示，GGA組HSP72表達明顯上調(diào)。GGA干預后7d組腎間質(zhì)纖維化分值顯著降低(P＜0.05)，為0.4±0.25。腎小管上皮TUNEL陽性細胞數(shù)(2.81±0.45)及P

7、CNA陽性細胞數(shù)減少(17.66±4.51)，與對照組凋亡細胞數(shù)(6.78±1.21)及增殖細胞數(shù)(113.7±6.36)相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。GGA干預后抗凋亡蛋白Bcl-2及上皮細胞連接E-cadherin恢復，肌成纖維細胞標志物α-SMA表達下調(diào)。但是，GGA3d及14d組未觀察到HSP72改善腎小管上皮凋亡及腎小管間質(zhì)纖維化的效應。 小結：UUO大鼠模型中腎小管上皮細胞凋亡及腎小管間質(zhì)纖維化程度隨梗阻時間延長

8、而加重。UUO7d時，HSP72可改善腎小管上皮細胞的凋亡及腎小管間質(zhì)纖維化。 第二章上調(diào)表達HSP72抑制腎小管上皮細胞凋亡對EMT的影響 目的：明確腎小管上皮細胞凋亡與EMT的關系，并探討上調(diào)表達HSP72抑制腎小管上皮細胞凋亡對EMT的影響。 方法：NRK-52E細胞分成A：無血清對照組；B：TGF-β1刺激組；C：pan-caspase抑制劑+TGF-β1組；D：腺病毒感染細胞高表達HSP72+TGF-β

9、1組，其中B組分不同濃度組(0.5、1、2.5、5、10、20ng/ml)和不同時間點組(6、12、24、48、72h)。C組pan-caspase抑制劑分不同濃度組(25、50、100、150μM)。熒光顯微鏡觀察腺病毒感染細胞的效率；相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變，間接免疫熒光及Western-blot檢測EMT標志物E-cadherin及α-SMA的變化；TUNEL及AnnexinV-FITC+PI雙染觀察細胞凋亡的變化，Weste

10、rn-blot檢測檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、pro-caspase3的變化。 結果：TGF-β1呈劑量及時間依賴性同時誘導腎小管上皮細胞EMT及凋亡。經(jīng)流式細胞儀檢測，不同濃度pan-caspase抑制劑組(25，50，100，150μM)凋亡發(fā)生率分別為(15.9±1.7)％、(21.1±7.8)％、(16.3±3.7)％、(17.4±4.6)％，與TGF-β1+DMSO組相比(36.6±11.3)％，有顯著性差異(P＜0.

11、05)。與TGF-β1刺激組相比，western-blot結果可見不同濃度pan-caspase抑制劑組(50，100，150μM)E-cadherin均有不同程度回升(P＜0.05)；但不同濃度pan-caspase抑制組組間無統(tǒng)計學差異。pan-caspase抑制劑處理后，α-SMA的表達未見明顯減弱，提示pan-caspase抑制劑不能改善腎小管上皮細胞EMT。含HSP72RNA的腺病毒感染腎小管上皮細胞后，熒光顯微鏡下可見GFP

12、熒光陽性率高達90％以上。Western-blot結果腺病毒感染組HSP72顯著增高，比對照組高3.41倍。與空載體組、pan-caspase抑制劑組相比，上調(diào)表達HSP72的腎小管上皮細胞，其α-SMA的蛋白水平明顯降低(P＜0.001)。 小結：Pan-caspase抑制劑預處理不能逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細胞EMT。上調(diào)表達HSP72可以明顯逆轉(zhuǎn)EMT，該效應可能不依賴于其抗腎小管上皮細胞凋亡的作用。 結論1.上調(diào)表達HSP