白藜蘆醇苷對(duì)缺氧-復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分：缺氧-復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞損傷的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制 目的：將人腎臟近曲小管上皮細(xì)胞株(Human renal proximaltubular epithelial cells，HK-2)為研究對(duì)象，體外人工模擬缺氧-復(fù)氧環(huán)境，探討缺氧-復(fù)氧(Hypoxia/Re-oxygenation，H/R)腎小管上皮細(xì)胞損傷的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。 方法：將HK-2細(xì)胞根據(jù)不同處理分為3組：對(duì)照組、缺氧-復(fù)氧組

2、(H/R組)和PDTC干預(yù)組。對(duì)照組HK-2細(xì)胞用DMEM常氧培養(yǎng)；H/R組HK-2細(xì)胞在缺氧下培養(yǎng)24小時(shí)后在常氧(復(fù)氧)下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；PDTC干預(yù)組HK-2細(xì)胞加入PDTC后在缺氧下培養(yǎng)24小時(shí)再常氧(復(fù)氧)培養(yǎng)24小時(shí)。于缺氧6、12、24小時(shí)和缺氧24小時(shí)后復(fù)氧6、12、24小時(shí)分別獲取各組標(biāo)本，應(yīng)用MTT法細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)HK-2細(xì)胞存活數(shù)，免疫組化法檢測(cè)NF-κB p65蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(Reverse tr

3、anscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法檢測(cè)細(xì)胞間粘附因子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)mRNA轉(zhuǎn)錄，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測(cè)ICAM-1蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：H/R組HK-2細(xì)胞數(shù)量在缺氧6小時(shí)明顯減少，24小時(shí)達(dá)最低值(呈時(shí)間依賴性)，

4、復(fù)氧后稍有升高，與對(duì)照組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，H/R組HK-2細(xì)胞NF-κB p65陽(yáng)性蛋白表達(dá)(平均光密度值)，ICAM-1mRNA表達(dá)(光密度比值)和ICAM-1蛋白濃度(pg/ml)表達(dá)在各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。PDTC組HK-2細(xì)胞數(shù)量多，NF-rB p65陽(yáng)性蛋白表達(dá)，ICAM-1mRNA轉(zhuǎn)錄和ICAM-1蛋白表達(dá)均降低，各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)分別與H/

5、R組和對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.82 1，P＜0.05，故可認(rèn)為ICAM-1蛋白濃度與NF-κBp65陽(yáng)性表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論： 1.本研究將HK-2細(xì)胞株置于無(wú)血清無(wú)糖DMEM中充以95％N2/5％CO2混合氣體進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，模擬體內(nèi)組織缺氧缺血再灌注環(huán)境，成功地復(fù)制了體外缺氧-復(fù)氧性HK-2細(xì)胞損傷模型。此方法操作簡(jiǎn)單、易行、結(jié)果穩(wěn)定。 2.H/R條件下

6、HK-2細(xì)胞培養(yǎng)呈時(shí)間依賴性地激活NF-κB，促進(jìn)ICAM-1mRNA轉(zhuǎn)錄及ICAM-1mRNA蛋白的表達(dá)。PDTC干預(yù)能明顯降低H/R近端腎小管上皮細(xì)胞ICAM-1mRNA轉(zhuǎn)錄和ICAM-1蛋白表達(dá)。 3.H/R導(dǎo)致HK-2細(xì)胞損傷的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制可能是H/R首先刺激NF-κB活化使得HK-2細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)增加進(jìn)而促進(jìn)多形核中性白細(xì)胞(Polymorphonuclear neutrophils，PMNs)的粘附。

7、 第二部分：白藜蘆醇苷對(duì)缺氧-復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究。 目的：探討白藜蘆醇苷(Polydatin，PD)對(duì)體外缺氧-復(fù)氧HK-2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。 方法：本實(shí)驗(yàn)HK-2細(xì)胞根據(jù)不同處理分為4組：對(duì)照組、H/R組、PDTC干預(yù)組和PD處理組。對(duì)照組HK-2細(xì)胞用DMEM常氧培養(yǎng)：H/R組HK-2細(xì)胞在缺氧下培養(yǎng)24小時(shí)后在常氧(復(fù)氧)下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)：PDTC干預(yù)組和PD處理組HK-2細(xì)胞均加入PD

8、TC后在缺氧下培養(yǎng)24小時(shí)再在常氧(復(fù)氧)下培養(yǎng)24小時(shí)。于缺氧24小時(shí)后復(fù)氧6小時(shí)分別獲取各組標(biāo)本，應(yīng)用MTT法細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)HK-A細(xì)胞存活數(shù)，免疫組化法檢測(cè)NF-κB p65蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)ICAM-1mRNA轉(zhuǎn)錄，ELISA法檢測(cè)ICAM-1蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果:PD處理組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)HK-2細(xì)胞數(shù)量明顯增多于H/R組，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。PD處理組NF-κB p65蛋白陽(yáng)性表達(dá)，ICAM-lmR