益肝康顆粒質(zhì)量控制方法研究.pdf

1、益肝康顆粒由丹參、黃芪、當(dāng)歸、赤芍、白術(shù)、茯苓、雞內(nèi)金、厚樸、柴胡9味藥材組成，是依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論組方，采用現(xiàn)代工藝生產(chǎn)的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑屬6類中藥新藥。經(jīng)臨床觀察，具有活血化瘀健脾的功效，用于治療慢性肝?。ㄑ祝?，對(duì)慢性乙肝、抗肝纖維化治療具有一定療效。
　　 本研究建立了益肝康顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。以丹參酮Ⅱ A、丹酚酸B、黃芪甲苷、芍藥苷、柴胡皂苷a、當(dāng)歸、白術(shù)為質(zhì)控指標(biāo)用薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別，并以丹參酮Ⅱ A、丹酚酸B、黃芪

2、甲苷、芍藥苷為指標(biāo)成分用反相高效液相色譜法進(jìn)行了含量測(cè)定。所建方法專屬性強(qiáng)，靈敏快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，精密度和穩(wěn)定性良好，可用于控制產(chǎn)品質(zhì)量。建立了益肝康顆粒中5種有效成分的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定方法，為全面控制其質(zhì)量提供了方法。建立了不同批次益肝康顆粒HPLC指紋圖譜，用相關(guān)軟件對(duì)制劑整體質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。比較了制劑與處方藥材指紋圖譜，歸屬了主要色譜特征峰的藥材來源，分析了大鼠給予益肝康顆粒后血清指紋圖譜的變化，為闡明中藥復(fù)方制劑的藥效物質(zhì)

3、基礎(chǔ)奠定了基礎(chǔ)。本研究建立了益肝康顆粒質(zhì)量的綜合分析方法，為全面評(píng)價(jià)與控制中藥復(fù)方制劑質(zhì)量提供了依據(jù)。
　　 第一部分
　　 益肝康顆粒的薄層色譜鑒別方法
　　 目的：為控制益肝康顆粒質(zhì)量，采用薄層色譜法對(duì)益肝康顆粒處方中的組成藥味進(jìn)行定性鑒別。為建立該藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：（1）鑒別藥味的選擇。（2）對(duì)照物的選擇。（3）供試品處理方法的選擇：比較不同提取方式、提取溶劑及提取時(shí)間對(duì)待測(cè)成分提

4、取效率的影響，選擇能有效排除干擾、富集待測(cè)成分的提取方法。（4）薄層色譜條件的優(yōu)化：選用合適的固定相，優(yōu)化展開劑的組成、配比、展開環(huán)境等影響因素，確定最佳的色譜條件。（5）顯色或檢視條件的確定：選用簡(jiǎn)便、可明顯的顯現(xiàn)并區(qū)別斑點(diǎn)的顯色劑或紫外光燈。（6）進(jìn)行專屬性實(shí)驗(yàn)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受益肝康顆粒中其它組成藥材中化學(xué)物質(zhì)的干擾。
　　 結(jié)果：（1）選取丹參、黃芪、赤芍、柴胡、當(dāng)歸、白術(shù)6味藥的定性鑒別列入益肝康顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。選用的對(duì)

5、照物分別為丹參酮ⅡA、丹酚酸B、黃芪甲苷、芍藥苷、柴胡皂苷a對(duì)照品及當(dāng)歸、白術(shù)對(duì)照藥材。對(duì)制劑中厚樸、雞內(nèi)金和茯苓的鑒別，雖采用多種樣品處理手段和展開系統(tǒng)，但供試品在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置處無特異斑點(diǎn)，或陰性干擾較大，故未列入標(biāo)準(zhǔn)中。（2）采用確定的薄層鑒別方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，供試品在與對(duì)照品或?qū)φ账幉纳V相應(yīng)的位置處顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。
　　 結(jié)論：所建方法專屬性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可以用于益肝康顆粒的定性鑒別，為控制制

6、劑質(zhì)量提供了可靠的方法。
　　 第二部分
　　 益肝康顆粒含量測(cè)定的方法學(xué)研究
　　 目的：為控制制劑質(zhì)量，建立了益肝康顆粒中有效成分的高效液相色譜含量測(cè)定方法。
　　 方法：（1）質(zhì)控指標(biāo)的選擇。（2）選擇能有效排除干擾、富集待測(cè)成分的提取方法。（3）確定色譜條件：選用合適的色譜柱，優(yōu)化流動(dòng)相組成、配比及流速，使待測(cè)成分與其他峰完全分離。（4）進(jìn)行方法學(xué)考察。（5）樣品含量測(cè)定。
　　 結(jié)果：（

7、1）根據(jù)益肝康顆粒的處方、制劑工藝及有關(guān)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究資料，選擇丹參中的丹參酮Ⅱ A、丹酚酸B，黃芪中黃芪甲苷，赤芍中芍藥苷作為質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定。（2）提取條件：丹參酮ⅡA和芍藥苷用甲醇超聲提取20min，可提取完全；丹酚酸B用水在冰水浴中超聲20 min可提取完全；黃芪甲苷需經(jīng)甲醇提取，水飽和正丁醇萃取，氨試液洗滌，過D101大孔樹脂以70％乙醇洗脫等多步操作。（3）最佳色譜條件：均采用十八烷基鍵合硅膠為填充劑的固定相；使用等度

8、洗脫：丹參酮ⅡA、丹酚酸B、黃芪甲苷、芍藥苷的流動(dòng)相分別為甲醇.水（80：20），乙腈-甲醇-0.08％甲酸水（37：111：252），乙腈.水（33：67），乙腈-0.05％磷酸溶液（18：82）。丹參酮Ⅱ A、丹酚酸B、芍藥苷采用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長分別為270 nm、286 nm、230 nm；黃芪甲苷采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，參數(shù)為漂移管溫度80℃；氮?dú)饬髁?.5 psi。（4）丹參酮Ⅱ A在0.1334～2.668μg，丹酚酸B在

9、0.104～2.08mg，黃芪甲苷在0.6930～13.86μg，芍藥苷在2.00～40.1μg具有良好線性關(guān)系。各方法重現(xiàn)性良好，RSD分別小于2.3％，1.5，1.6，2.9。丹參酮ⅡA、丹酚酸B、黃芪甲苷、芍藥苷加樣回收率分別為100.9％，100.5％，98.0％，101.7％，RSD分別小于2.5％，2.3％，1.2％和1.1％。
　　 結(jié)論：本研究采用反相高效液相色譜法建立了益肝康顆粒中丹參酮ⅡA、丹酚酸B、黃芪甲苷

10、、芍藥苷4種成分的含量測(cè)定方法。方法專屬性強(qiáng)，靈敏快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，精密度和穩(wěn)定性良好。本研究建立的方法可以用于益肝康顆粒的含量測(cè)定，作為該制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
　　 Ⅱ第三部分益肝康顆粒有效成分的多組分同時(shí)分析
　　 目的：采用反相高效液相色譜法建立益肝康顆粒有效成分的多組分同時(shí)分析方法，并將所建立的方法用于不同批次制劑的含量測(cè)定，為全面評(píng)價(jià)與控制益肝康顆粒的質(zhì)量提供方法。
　　 方法：（1）比較不同提取方式、

11、提取溶劑及提取時(shí)間，選擇效率高的提取方法。（2）選用適宜的色譜柱和檢測(cè)波長，優(yōu)化流動(dòng)相的組成、配比、梯度洗脫程序、柱溫等影響因素，確定最佳的色譜條件。（3）進(jìn)行系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)及方法學(xué)考察。（4）用建立的方法，對(duì)不同批次樣品進(jìn)行多組分同時(shí)測(cè)定。
　　 結(jié)果：（1）提取方法：益肝康顆粒加水超聲處理10 min，再加甲醇超聲處理10 min。（2）HPLC色譜條件：采用Restek PinnacleⅡ C18色譜柱（250 mm×4.

12、6 mm，5μm）。流動(dòng)相A為0.1％磷酸水溶液；流動(dòng)相B為甲醇-乙腈（50：50）；洗脫程序?yàn)椋?～5 min1％B；8 min5％B；30 min35％B；40 min45％B；50 min80％B；60 min90％B。采用DAD檢測(cè)器雙波長同時(shí)監(jiān)測(cè)，檢測(cè)波長為：芍藥苷230 nm；沒食子酸、丹參素、丹酚酸B和丹參酮Ⅱ A270 nm。（3）沒食子酸、丹參素、芍藥苷、丹酚酸B和丹參酮Ⅱ A分別在31.40～376.8，452.7～

13、5659，201.6～2520，1657～20710和54.33～679.2μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為102.5％，104.6％，99.4％，105.0％，102.9％，RSD均小于3.5％。
　　 結(jié)論：本研究采用反相高效液相色譜法建立了益肝康顆粒多組分同時(shí)分析方法。采用雙波長同時(shí)監(jiān)測(cè)的方式，既保證了含量測(cè)定所需的檢測(cè)靈敏度，又處理方便。方法專屬性強(qiáng)，靈敏快速、準(zhǔn)確可靠，精密度和穩(wěn)定性良好。本研究建立的方法可

14、以用于同時(shí)測(cè)定益肝康顆粒中多個(gè)有效成分，為全面控制質(zhì)量提供了簡(jiǎn)捷的分析方法。
　　 第四部分
　　 益肝康顆粒的高效液相色譜指紋圖譜研究
　　 目的：建立益肝康顆粒的高效液相指紋圖譜分析方法，利用相似度對(duì)多批制劑整體質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)；用該法比較制劑與組成藥材的HPLC指紋圖譜，歸屬制劑指紋圖譜中主要色譜特征峰的藥材來源；考察大鼠給予益肝康顆粒后血清指紋圖譜，為闡明益肝康顆粒的藥效物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：1

15、.建立益肝康顆粒HPLC指紋圖譜方法：（1）確定色譜條件及樣品處理方法。（2）進(jìn)行方法學(xué)考察。（3）對(duì)不同批次的益肝康顆粒進(jìn)行指紋圖譜分析。（4）采用相關(guān)軟件對(duì)所得指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。2.采用所建方法對(duì)益肝康顆粒組成藥材進(jìn)行分析。3.大鼠灌胃給予益肝康顆?；鞈乙汉?，取血清進(jìn)行指紋圖譜分析。
　　 結(jié)果：1.益肝康顆粒的HPLC指紋圖譜研究：（1）提取方法：益肝康顆粒加水超聲10 min，再加甲醇超聲處理10min。（2）HPL

16、C色譜指紋圖譜條件：選用C18柱；以0.1％磷酸（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫：0 min2％B；10 min10％B；25～30 min25％B；55 min75％B；檢測(cè)波長為275 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30℃。（3）方法精密度高、重現(xiàn)性好，方法學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)均符合指紋圖譜要求。（4）對(duì)10批益肝康顆粒進(jìn)行了指紋圖譜分析，共標(biāo)定了17個(gè)共有峰，相似度在0.961～0.993之間。2.對(duì)益肝康顆粒中主要色譜特征峰