丹參對(duì)凍融小鼠卵巢同種異體移植缺血損傷的早期抗氧化保護(hù)作用.pdf

1、目的： 半個(gè)世紀(jì)以來(lái)的研究表明卵巢組織的冷凍保存和卵巢移植是目前保留癌癥患者生育能力的較好方法之一[1]。然而，由于沒(méi)有血管吻合，移植的卵巢組織血供單純依賴于移植后的血管新生和重建，移植后相當(dāng)一段的時(shí)間內(nèi)處于缺血缺氧狀態(tài)而導(dǎo)致大量卵泡丟失，已成為阻礙移植卵巢組織功能恢復(fù)的關(guān)鍵問(wèn)題[2]，因此如何減少移植卵巢組織的缺血損傷，誘導(dǎo)血管發(fā)生是凍融卵巢組織臨床應(yīng)用的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。傳統(tǒng)中藥丹參是一種常用的活血化瘀中藥，它能清除自由基、改

2、善血流變化和微循環(huán)狀態(tài)，許多研究表明丹參對(duì)心、肝、肺等多種組織器官的缺血-再灌注損傷具有明顯的改善作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)丹參對(duì)凍融小鼠卵巢同種異體移植早期的干預(yù)研究，應(yīng)用組織學(xué)及RT-PCR技術(shù)觀察移植早期卵巢中抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的變化及移植后卵巢形態(tài)學(xué)的改變來(lái)了解丹參注射液是能否通過(guò)其抗氧化功能改善卵巢移植早期的缺血損傷從而提高卵泡的存活率，探討丹參干預(yù)的分子生物學(xué)機(jī)制，為人卵巢組織冷凍保存和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：

3、實(shí)驗(yàn)由三個(gè)部分組成，第一部分：凍融過(guò)程對(duì)小鼠卵巢組織卵泡數(shù)量和凋亡的影響。新鮮組為B6C2F1第一天新生(D1)小鼠卵巢，凍融組為冷凍解凍后的新生小鼠卵巢，兩組卵巢組織石蠟包埋后4μm連續(xù)切片，H染色在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行總原始卵泡計(jì)數(shù)和凋亡(Tunel)的檢測(cè)。第二部分：分別為14天新鮮組、14天回收移植對(duì)照組和14天回收移植丹參組。14天新鮮組為14天B6C2F1小鼠的新鮮卵巢，14天回收移植對(duì)照組和14天回收移植丹參組處理如下：收集B

4、6C2F1第一天新生(D1)小鼠卵巢，慢凍速融后移植至B6C2F1代8-12周雄鼠的腎被膜下，移植前一天至回收當(dāng)日分別給予受體小鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.5 ml和丹參注射液0.5 ml(含丹參0.15 g)，于移植后14天回收移植物行石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，HE染色光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組化分析。第三部分：分別為移植對(duì)照組和移植丹參組，兩組處理同第二部分，分別于移植后1d(24h)，2d(48h)

5、和14d回收移植物，進(jìn)行SOD(超氧化物歧化酶)和iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)的RT-PCR半定量測(cè)定。 結(jié)果： 一、凍融過(guò)程對(duì)新生小鼠卵巢卵泡數(shù)量和凋亡的影響 1、原始卵泡計(jì)數(shù)：新鮮組和凍融組初生小鼠卵巢中含大量的原始卵泡，與新鮮組相比，凍融組的總原始卵泡數(shù)有所下降，但兩組間無(wú)顯著性差異，P>0.05，分別為(7124±858) VS(6542±929)。 2、凋亡的檢測(cè)：新鮮組和凍融組初生小鼠卵巢皮

6、質(zhì)區(qū)分散著少數(shù)凋亡細(xì)胞，凍融組卵巢中平均每高倍視野(×400油鏡)下(12±2)個(gè)凋亡細(xì)胞略多于新鮮組(10±1)，但兩者無(wú)顯著差異。 二、丹參對(duì)凍融新生小鼠卵巢同種異體移植卵泡存活率及卵泡增殖的影響 1、PCNA免疫組化分析：14天回收卵巢移植物對(duì)照組和丹參組的陽(yáng)性率分別為85-90％和80％-85％，兩組無(wú)顯著性差異。 2、各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)及卵泡存活率：以14天新鮮卵巢作為基數(shù)，14天回收移植對(duì)照組和丹參組的原始

7、卵泡明顯減少，分別為(3550±250) VS(1340±60) VS(1730±180)，其中丹參組的原始卵泡數(shù)多于對(duì)照組，存在顯著差異(P<0.05)，另外14天回收移植物行全卵巢卵泡計(jì)數(shù)和計(jì)算卵泡存活率，結(jié)果顯示初級(jí)卵泡，竇前卵泡和竇卵泡，移植丹參組均多于對(duì)照組，分別為(1889±202) VS(2709±234)，(280±120) VS(560±65)，(249±23) VS(311±97)和(20±1)VS(48±7)，差異

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。移植丹參組卵泡存活率顯著高于對(duì)照組，為66.1％VS44.7％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)。 三、丹參對(duì)凍融小鼠卵巢組織移植物抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響 1、移植丹參組中各時(shí)間段的SOD-mRNA的表達(dá)均高于移植對(duì)照組，分別為(0.19±1.21) VS(0.45±0.23)，(0.20±0.11) VS(0.51±0.12)和(0.19±0.11)VS(0.50±0.21)，P<0.

9、05存在顯著性差異。 2、移植丹參組中各時(shí)間段的iNOS-mRNA的表達(dá)均低于移植對(duì)照組，分別為(0.30±0.05) VS(0.38±0.13)，(0.21±0.15) VS(0.47±0.03)和(0.16±0.03)VS(0.42±0.02)，P<0.05存在顯著差異。 結(jié)論： 1、凍融前后初生小鼠卵巢的原始卵泡無(wú)明顯減少，凋亡細(xì)胞無(wú)明顯增加，表明本實(shí)驗(yàn)采用二甲亞砜(DSMO)作為冷凍保護(hù)劑的慢凍速融法適合

10、小鼠卵巢的冷凍保存，且冷凍和解凍過(guò)程未造成原始卵泡的大量丟失。 2、移植對(duì)照組和移植丹參組14天回收的卵巢可見(jiàn)各級(jí)卵泡，表明原始卵泡均有發(fā)育，并到達(dá)竇卵泡階段，增殖細(xì)胞抗原(PCNA)的檢測(cè)證實(shí)了兩組組織均處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。但14d回收的兩移植組卵巢中原始卵泡數(shù)及總卵泡數(shù)大大少于14d新鮮小鼠卵巢，證實(shí)了卵巢組織移植過(guò)程中由于無(wú)直接血管吻合導(dǎo)致大部分原始卵泡的丟失。其中移植丹參組14天回收的全卵巢卵泡計(jì)數(shù)和各級(jí)卵泡的比較明顯多

11、于對(duì)照組，而移植丹參組的卵泡存活率高于移植對(duì)照組，說(shuō)明丹參可能有助于減少移植卵巢卵泡的丟失，提高卵泡生存率。 3、移植丹參組3個(gè)時(shí)間段回收卵巢組織中的SOD-mRNA基因表達(dá)均高于對(duì)照組，而iNOS-mRNA基因的表達(dá)低于對(duì)照組，提示丹參可能通過(guò)上調(diào)SOD-mRNA的表達(dá)，清除氧自由基，下調(diào)iNOS-mRNA的表達(dá)，抑制NO過(guò)度產(chǎn)生。 綜上所述，丹參注射液可能通過(guò)上調(diào)SOD-mRNA的表達(dá)，抑制iNOS-mRNA的表達(dá)而