血紅素加氧酶—1高表達(dá)對(duì)大鼠同種異體肺移植物缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、第一部分: 改良三袖套法建立大鼠左肺原位移植動(dòng)物模型目的采用改良袖套法技術(shù)建立大鼠同種異體左肺移植模型。方法對(duì)供肺獲取、套管制作、自體肺切除、血管和氣管袖套套接技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。30例清潔級(jí)SD大鼠左供肺獲取后置于4℃的LPDG液保存3小時(shí)，隨后行肉眼直視下同種異體左肺移植術(shù)，再灌注4h后阻斷右肺門(mén)，分別測(cè)定阻斷前后氣道壓力、動(dòng)脈血?dú)庾兓?、肺W/D比率及光鏡下肺組織結(jié)構(gòu)變化。評(píng)價(jià)該模型復(fù)制移植物IRI的能力。結(jié)果周種異體左肺移植模型

2、在肉眼直視下單人完成，供受體動(dòng)靜脈和支氣管套管吻合時(shí)間分別為：肺動(dòng)脈(4±1)min、肺靜脈(8±3)min、支氣管(2±0.5)min?？偸中g(shù)時(shí)間(55±10)min。手術(shù)成功率90％(27/30)，術(shù)后生存率100％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該模型成功復(fù)制出同種異體肺移植IRI的變化。結(jié)論本模型符合大鼠肺移植模型建立的優(yōu)點(diǎn)，全部操作在肉眼直視下單人完成；供肺的獲取較為快速，使用的套管更簡(jiǎn)單，套管技術(shù)趨于簡(jiǎn)化，肺移植時(shí)血管套接技術(shù)成功率高，整體手

3、術(shù)時(shí)間操作縮短。該模型復(fù)制出移植肺IRI的變化，是適合肺移植IRI研究的理想模型。 第二部分: 內(nèi)源性HO-1高表達(dá)對(duì)大鼠同種異體肺移植物缺血再灌注損傷的作用研究目的觀察CoPP誘導(dǎo)內(nèi)源性HO-1高表達(dá)對(duì)大鼠同種異體左肺移植物IRI的影響并探討其作用機(jī)制。方法以SD大鼠為供受體，采用改良袖套法技術(shù)建立同種異體左肺移植模型。設(shè)立空白對(duì)照組(A組)、CoPP+ZnPP組(B組)和CoPP組(C組)，離體供肺靜脈40c的LPD

4、G液逆行灌注，灌注后供肺保存3h后行左肺原位移植，移植肺再灌注4h后，阻斷右肺門(mén)，測(cè)量氣道壓力，動(dòng)脈血PaO2、PaCO2。隨后處死大鼠，分別測(cè)定：肺W/D比率、肺組織中SOD活性、MDA含量、MPO活性；光鏡觀察移植物病理組織學(xué)變化；PCR和免疫組化了解HO-1表達(dá)：ELISA檢測(cè)移植肺TNF-α量的變化；免疫組化檢測(cè)TNF-α、IL-10、bcl-2表達(dá)情況；TUNEL法檢測(cè)移植肺細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果基因和蛋白水平檢測(cè)顯示C組肺組織H

5、O-1較A組、B組明顯升高(P<0.01)，表明C組供肺成功高表達(dá)HO-1。與A、B組相比，C組氣道壓力降低、PaO2上升、肺W/D比率下降，SOD活性增高，MDA含量和MPO活性下降(P<0.01)；病理檢查C組肺泡間質(zhì)水腫明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺泡腔內(nèi)水腫液和紅細(xì)胞少見(jiàn)；免疫組化TNF-α表達(dá)減弱、IL-10表達(dá)增強(qiáng)，bc1-2表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)：TUNEL法檢測(cè)移植肺細(xì)胞凋亡減少(P<0.01)。結(jié)論 CoPP有效誘導(dǎo)

6、移植肺高表達(dá)內(nèi)源性HO-1。HO-1通過(guò)其抗氧化、抗炎和抗凋亡等多種途徑明顯減輕供肺IRI，提高肺移植術(shù)后早期肺功能。因此應(yīng)用CoPP誘導(dǎo)移植肺局部高表達(dá)內(nèi)源性HO-1可成為預(yù)防和減輕同種異體肺移植IRI的一種策略。 第三部分: 腺病毒介導(dǎo)HO-1離體轉(zhuǎn)基因?qū)Υ笫笸N異體肺移植物缺血再灌注損傷的影響目的觀察腺病毒介導(dǎo)HO-1轉(zhuǎn)基因?qū)Υ笫笸N異體左肺移植物IRI的影響并探討其作用機(jī)制。方法以SD大鼠為供受體，采用改良袖套法

7、技術(shù)建立同種異體左肺移植模型。設(shè)立空白對(duì)照組(I組)行離體供肺靜脈4℃ LPDG液逆行灌注，空載體對(duì)照組(Ⅱ組)和基因轉(zhuǎn)染組(Ⅲ組)分別行肺靜脈逆行灌注4℃LPDG液稀釋的空病毒載體和重組腺病毒載體(6.1×1010v.p/ml)。供肺保存3h后行左肺原位移植，移植肺再灌注4h后，阻斷右肺門(mén)，測(cè)量氣道壓力，動(dòng)脈血PaO2、PaCO2。隨后處死大鼠測(cè)定：肺W/D比率、肺組織中SOD活性、MDA含量、MPO活性；光鏡觀察移植物病理組織學(xué)變化

8、；PCR和免疫組化法測(cè)定肺組織HO-1表達(dá)：ELISA檢測(cè)移植肺TNF-a量的變化；免疫組化檢測(cè)TNF=-α、IL-10、bcl-2表達(dá)情況：TUNEL法檢測(cè)移植肺細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果基因和蛋白水平檢測(cè)顯示Ⅲ組肺組織HO-1表達(dá)較Ⅰ組、Ⅱ組明顯升高(P<0.01)，表明Ⅲ組供肺成功特異性轉(zhuǎn)染外源性HO-1目的基因。與Ⅰ組、Ⅱ組相比，Ⅲ組氣道壓力降低、PaO2上升、肺W/D下降、SOD活性增高、MDA含量和MPO活性下降(P<0.01)；光

9、鏡檢查Ⅲ組肺泡間質(zhì)水腫明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡腔內(nèi)水腫和滲出改變明顯減輕；免疫組化移植肺TNF-α表達(dá)減弱，IL-10表達(dá)增強(qiáng)：bcl-2表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)，TUNEL法檢測(cè)移植肺細(xì)胞凋亡減少(P<0.01)。結(jié)論 Ad5-HO-1的構(gòu)建為開(kāi)展HO-1基因治療創(chuàng)造了有利條件。腺病毒介導(dǎo)HO-1轉(zhuǎn)基因治療能成功地在移植肺高表達(dá)外源性HO-1目的基因。HO-1通過(guò)其抗氧化、抗炎和抗凋亡等多種途徑明顯減輕供肺IRI，提高肺移植術(shù)后早