miR-214通過靶定GALNT7抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲.pdf

1、目的：多種癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)導(dǎo)致了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。目前對(duì)其機(jī)制的研究已取得一些成果。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調(diào)控功能的非編碼單鏈小RNA分子，它通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，UTR)以堿基配對(duì)的方式特異性結(jié)合，使靶基因翻譯抑制或使mRNA降解。GALNT7是多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(polypeptideN-acetylgalactosami

2、nyltransferase，ppGalNAc-T)家族中的成員，是催化O-聚糖合成第一步的酶，O-糖基化與細(xì)胞識(shí)別、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和粘附等功能密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期工作利用cDNA微陣列分析首次發(fā)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞中抑制miR-214后GALNT7的水平上升。本文將探究miR-214對(duì)GALNT7的調(diào)控作用，及其對(duì)宮頸癌生物學(xué)表型的影響。
　　方法：首先用生物信息學(xué)方法篩選GALNT7為miR-214的候選靶基因，利用熒光報(bào)告

3、載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-214對(duì)GALNT7的直接調(diào)控作用。通過qRT-PCR和Western blot方法在宮頸癌細(xì)胞系中檢測(cè)了miR-214對(duì)GALNT7的mRNA和蛋白水平的影響。并用qRT-PCR方法和免疫組化方法在宮頸癌組織及其癌旁正常組織中進(jìn)一步驗(yàn)證miR-214對(duì)GALNT7的調(diào)控關(guān)系。然后在宮頸癌細(xì)胞系中，過表達(dá)miR-214和封閉miR-214后利用MTT實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)和tanswell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞系表型的變化。

4、利用RNA干擾技術(shù)沉默GALNT7來(lái)檢測(cè)細(xì)胞表型的變化。最后用挽救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-214對(duì)GALNT7調(diào)控的特異性。
　　結(jié)果：miRNA篩選結(jié)果表明，GALNT7是miR-214的靶基因，其3’非翻譯區(qū)包含miR-214的潛在結(jié)合位點(diǎn)。熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-214能夠通過作用于GALNT7基因的3’非翻譯區(qū)對(duì)其表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。qRT-PCR和Westernblot的結(jié)果表明miR-214能夠影響GALNT7 mRNA和

5、蛋白的表達(dá)水平。與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織內(nèi)miR-214的表達(dá)明顯降低，而GALNT7的mRNA和蛋白水平明顯增高。在宮頸癌細(xì)胞系中，過表達(dá)miR-214后，細(xì)胞生長(zhǎng)活性下降、集落形成能力明顯降低、遷移和侵襲能力也明顯下降；封閉了miR-214之后結(jié)果相反。此外，沉默GALNT7后宮頸癌細(xì)胞的增殖活性、集落形成能力以及遷移和侵襲能力都明顯下降。挽救實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)GALNT7則能抑制miR-214對(duì)宮頸癌細(xì)胞的效應(yīng)。
　　結(jié)論