miR-214對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901侵襲遷移能力的影響.pdf

1、背景：胃癌是常見的惡性腫瘤，盡管胃癌的診斷和治療取得了一些進(jìn)展，但是胃癌患者的預(yù)后仍不令人滿意，浸潤和轉(zhuǎn)移是其預(yù)后不良的主要原因。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是目前腫瘤研究中最受關(guān)注的生物大分子之一。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的轉(zhuǎn)移與浸潤當(dāng)中起了重要的作用，它們可以通過抑制靶基因的表達(dá)參與到細(xì)胞外基質(zhì)降解、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及腫瘤血管生成過程中，影響腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。胃癌浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs研究比較少，日本學(xué)者對(duì)

2、353例臨床胃癌進(jìn)行了miRNAs表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)miR-214高表達(dá)是胃癌浸潤深度、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。我們前期研究中也發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株BGC823、MKN45和SGC7901中miR-214的表達(dá)水平比正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1增高。關(guān)于miR-214的靶基因及作用機(jī)制也有研究：Li等發(fā)現(xiàn)，在炎癥反應(yīng)中，miR-214通過與PTEN mRNA的3’-非翻譯區(qū)結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄翻譯，使人單核巨噬細(xì)胞株THP-1凋亡延遲。J

3、indra等發(fā)現(xiàn)，在T細(xì)胞活化中，miR-214表達(dá)升高，并且與PTEN的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。有研究也發(fā)現(xiàn)，miR-214在卵巢癌中可以抑制PTEN的轉(zhuǎn)錄后翻譯，激活P13K/AKT信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)順鉑耐藥。但是miR-214是否確實(shí)為浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素，尚需大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，其作用機(jī)制也有待深入研究。
　　 目的：探討miR-214對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901侵襲遷移能力的影響及其可能作用機(jī)制。
　　 方法

4、：⑴應(yīng)用miRanda靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站和TarBase數(shù)據(jù)庫分析PTEN是否為。miR-214靶基因，并確定PTEN mRNA與miR-214可能結(jié)合位點(diǎn)。⑵分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-214 mimics，inhibitors和無關(guān)序列到SGC7901細(xì)胞株，以無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組(NC組)為陰性對(duì)照，以空白轉(zhuǎn)染組(control組)為空白對(duì)照，轉(zhuǎn)染24h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。⑶Real-time PCR法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞mi

5、R-214表達(dá)水平。⑷用Western blot的方法比較不同轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞PTEN蛋白的表達(dá)。⑸用Transwell侵襲小室，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-214 mimics，inhibitors后SGC7901細(xì)胞侵襲遷移能力變化。
　　 結(jié)果：①應(yīng)用TarBase，miRanda發(fā)現(xiàn)PTEN是miR-214的靶基因之一，并且miR-2145’-種子序列區(qū)和PTEN mRNA3’-UTR

6、保守序列有連續(xù)的堿基互補(bǔ)，結(jié)合后形成的miRNA：mRNA二聚體有一定的穩(wěn)定性。②轉(zhuǎn)染24h后，在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，miR-214 mimics和inhibitors轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率達(dá)80％以上。③轉(zhuǎn)染24h后，Real-time PCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組中miR-214的相對(duì)表達(dá)量，轉(zhuǎn)染miR-214 mimics組和inhibitors組細(xì)胞中miR-214表達(dá)量分別是control組的82902.31倍，0.

7、16倍。④Western blot結(jié)果：SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-214 mimics后，PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)水平(PTEN/GAPDH灰度比值，0.049±0.007)，比轉(zhuǎn)染無關(guān)序列組(0.087±0.007)，轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitors組(0.093±0.010)和空白轉(zhuǎn)染組(0.099±0.012)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑤Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果：轉(zhuǎn)染miR-214 mimics組

8、侵襲細(xì)胞數(shù)為43.60±4.39，明顯高于無關(guān)序列組(25.80±7.79)，轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitors組(16.60±5.32)和空白轉(zhuǎn)染組(24.60±6.54)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。而轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitors組侵襲細(xì)胞數(shù)與無關(guān)序列組，空白轉(zhuǎn)染組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。⑥Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果：轉(zhuǎn)染miR-214 mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)為39.00±6.04，

9、明顯高于無關(guān)序列組(26.20±2.39)，轉(zhuǎn)染miR-214inhibitors組(20.00±2.55)和空白轉(zhuǎn)染組(20.40±4.77)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitors組穿膜細(xì)胞數(shù)與無關(guān)序列組，空白轉(zhuǎn)染組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。⑦細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果：在不同劃痕愈合時(shí)間點(diǎn)，轉(zhuǎn)染miR-214mimics組的劃痕寬度與其他三個(gè)轉(zhuǎn)染組同時(shí)間點(diǎn)的劃痕寬度窄，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)