DADS上調(diào)miR-7靶向XIAP抑制人胃癌細(xì)胞增殖和侵襲.pdf

1、胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類的健康和生命。隨著社會經(jīng)濟發(fā)展與生活水平的提高，在歐美等發(fā)達國家其發(fā)病率和死亡率呈明顯下降趨勢，然而在亞洲、拉丁美洲仍然高發(fā)。由于其發(fā)病機制非常復(fù)雜，其預(yù)后仍不容樂觀。
　　二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）是大蒜中的脂溶性有效成分，可抑制多種腫瘤發(fā)生發(fā)展。我們前期研究證實，DADS能在體內(nèi)外抑制人胃癌細(xì)胞增殖，其機制與G2/M期阻滯、p38激活、ERK抑制及其他多

2、條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常有關(guān)。
　　MicroRNAs是一類小分子非編碼RNA，近年研究表明，其與胃癌的關(guān)系密切，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，在胃癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮了重要作用。miR-7是23個核苷酸miRNA，在多種腫瘤中低表達，具有潛在的抑瘤功能。
　　XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis）作為凋亡抑制因子家族（inhibitor of apoptosis protein，IAP）成員

3、之一，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著癌基因作用，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、凋亡、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　我們前期采用miRNA芯片技術(shù)篩選 DADS處理人胃癌細(xì)胞的差異miRNA表達，發(fā)現(xiàn)DADS處理后人胃癌細(xì)胞miR-7明顯上調(diào)。同時，qRT-PCR驗證miR-7在胃癌組織與胃癌細(xì)胞株中顯著下調(diào)。蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)XIAP等24種差異表達的蛋白質(zhì)，并驗證顯示，多株人胃癌細(xì)胞XIAP高表達，而DADS處理胃癌細(xì)胞后，XIAP明顯下調(diào)。
　

4、　本實驗分三部分探討miR-7和XIAP對人胃癌細(xì)胞增殖侵襲的影響及二者相互關(guān)系。
　　第一部分、DADS上調(diào)miR-7抑制人胃癌細(xì)胞增殖和侵襲
　　目的：探討DADS和miR-7對人胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。
　　方法：構(gòu)建miR-7高表達和沉默病毒載體，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染，建立miR-7穩(wěn)定高表達和沉默的SGC-7901和HGC-27細(xì)胞系，同時各組細(xì)胞經(jīng)30mg/l DADS處理，然后采用qRT-PCR、CCK-8、平

5、板克隆、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實驗、遷移實驗、侵襲實驗和裸鼠移植等分析DADS和miR-7對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用。
　　結(jié)果：qRT-PCR證實成功構(gòu)建miR-7穩(wěn)定高表達和沉默的SGC-7901和HGC-27細(xì)胞系，且DADS能上調(diào)各組細(xì)胞miR-7的表達。DADS和miR-7高表達分別可顯著抑制SGC-7901和HGC-27細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，抑制SGC-7901細(xì)胞克隆形成。劃痕實驗和Tran

6、swell遷移和侵襲實驗表明，DADS和miR-7高表達分別可顯著抑制SGC-7901和HGC-27細(xì)胞遷移和侵襲能力。裸鼠成瘤實驗也表明DADS組和miR-7高表達組腫瘤生長較慢，瘤體較小，較對照組有顯著性差異（P<0.05）。而miR-7沉默后表現(xiàn)出與miR-7高表達相反的結(jié)果。各組實驗均表明，miR-7高表達可協(xié)同DADS抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、移植瘤生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯，反之，miR-7沉默可拮抗DADS的作用。

7、
　　第二部分、DADS下調(diào)XIAP抑制人胃癌細(xì)胞增殖和侵襲
　　目的：探討DADS和XIAP對人胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。
　　方法：免疫組織化學(xué)檢測組織芯片中胃癌組織XIAP的表達情況，構(gòu)建XIAP高表達病毒載體和沉默質(zhì)粒，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染，建立XIAP穩(wěn)定高表達和沉默的SGC-7901和HGC-27細(xì)胞系，同時各組細(xì)胞分別經(jīng)30mg/l DADS處理，然后采用qRT-PCR、Western blot、細(xì)胞免疫熒光、C

8、CK-8、平板克隆、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實驗、遷移實驗、侵襲實驗以及裸鼠移植等分析DADS和XIAP對人胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用。
　　結(jié)果：XIAP在胃癌中呈強陽性表達，陽性部位主要在細(xì)胞質(zhì)中，而正常上皮及不典型增生上皮呈陰性或部分陽性表達，陽性表達率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。qRT-PCR證實成功構(gòu)建XIAP穩(wěn)定高表達和沉默的SGC-7901和HGC-27細(xì)胞系，且DADS能下調(diào)各組細(xì)胞XIAP的表達。Western b

9、lot實驗也表明XIAP沉默的SGC-7901和HGC-27細(xì)胞XIAP表達下降，而XIAP高表達組則XIAP表達上升，DADS可使各組XIAP表達均下降。細(xì)胞免疫熒光亦發(fā)現(xiàn)，XIAP陽性表達主要在細(xì)胞質(zhì)中，XIAP表達水平與Western blot實驗一致。DADS和XIAP沉默分別可顯著抑制SGC-7901和HGC-27細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，抑制SGC-7901細(xì)胞克隆形成。劃痕實驗和Transwel

10、l遷移和侵襲實驗表明，DADS和XIAP沉默可分別顯著抑制SGC-7901和HGC-27細(xì)胞遷移和侵襲能力。裸鼠成瘤實驗也表明DADS組和XIAP沉默組腫瘤生長較慢，腫瘤瘤體較小，較對照組有顯著性差異（P<0.05）。這些實驗結(jié)果與miR-7高表達一致，而XIAP高表達后表現(xiàn)出與XIAP沉默相反的結(jié)果。而且，各組實驗均表明，XIAP沉默可協(xié)同DADS抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期阻滯以及抑制移植瘤生長的作用，同時，亦可拮抗XI

11、AP過表達的作用。
　　第三部分、miR-7靶向負(fù)性調(diào)控XIAP的表達
　　目的：探討miR-7和XIAP的靶向關(guān)系。
　　方法：從miRNAbase數(shù)據(jù)庫查找成熟miR-7序列，同時從GenBank查詢 XIAP3’UTR序列；利用在線數(shù)據(jù)庫DIANA-microT-CDS、Targetscan和miRANDA進行靶基因預(yù)測，然后構(gòu)建包含XIAP-3’UTR-WT和XIAP-3’UTR-MT雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，與

12、miR-7高表達載體共轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，檢測熒光素酶報告基因活性；最后通過qRT-PCR和Western blot檢查miR-7穩(wěn)定高表達和沉默的SGC-7901和HGC-27細(xì)胞XIAP mRNA和蛋白的表達，最終確定miR-7與XIAP的靶向關(guān)系。
　　結(jié)果：在獲取miR-7成熟序列和XIAP3’UTR序列基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-7與XIAP3’UTR存在多個結(jié)合位點，三個在線軟件均預(yù)測XIAP為miR-

13、7的靶基因之一；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證實miR-7與XIAP3’UTR野生型共轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，其熒光值與對照組比較，明顯下降；miR-7穩(wěn)定高表達的SGC-7901和HGC-27細(xì)胞XIAP mRNA和蛋白表達水平均下調(diào)，反向?qū)嶒烌炞CmiR-7穩(wěn)定沉默的SGC-7901和HGC-27細(xì)胞XIAP mRNA和蛋白水平均上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.DADS可上調(diào)miR-7抑制人胃癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲與移植瘤生長和誘導(dǎo)