HPV6b型E7蛋白抗體制備及尖銳濕疣原代細(xì)胞培養(yǎng)研究.pdf

1、背景：
　　 人乳頭瘤病毒6b型(Humanpapillomavirustype6b，HPV6b)屬低危型HPV，其感染引起的皮膚和肛門外生殖器粘膜良性疣狀增生性病變是臨床常見病和多發(fā)病。宿主局部免疫抑制和/或?qū)PV蛋白的異常識別導(dǎo)致的病毒免疫逃逸和持續(xù)感染是HPV感染相關(guān)疾病難治的主要原因。因此HPV免疫致病機(jī)制及干預(yù)策略的研究將為探究HPV感染有效的治療和預(yù)防手段打下基礎(chǔ)。HPV早期基因編碼的E7蛋白是主要的致病蛋白，在H

2、PV持續(xù)感染乃至致癌機(jī)制中具有重要作用，也是目前HPV治療性疫苗主要的靶位點(diǎn)之一。大量獲得HPV6b型E7蛋白及其多克隆抗體將為進(jìn)一步開展HPV6bE7蛋白的功能研究、以其為靶向的免疫學(xué)干預(yù)手段提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)，建立尖銳濕疣來源體外培養(yǎng)的穩(wěn)定表達(dá)HPV基因的人角質(zhì)形成細(xì)胞株對HPV免疫學(xué)致病機(jī)制的研究有重要意義。
　　 目的：
　　 本研究將在已有實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)大量可溶性融合蛋白GST-HPV6bE7，純化所

3、得的HPV6bE7蛋白免疫新西蘭兔獲得抗HPV6bE7血清并純化為多克隆抗體IgG。建立正常包皮及尖銳濕疣組織來源的穩(wěn)定表達(dá)HPV基因的人角質(zhì)形成細(xì)胞株并鑒定HPV型別。
　　 方法：
　　 用已構(gòu)建的pGEX-4T-2/HPV6bE7原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，應(yīng)用IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集菌液，行超聲粉碎裂解菌液。二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析鑒定細(xì)菌裂解上清中的可溶性蛋白。表達(dá)的大量可

4、溶性融合蛋白GST-HPV6bE7，經(jīng)Glutathione-Sepharose4B親和柱和凝血酶純化獲取HPV6b型E7蛋白。將純化的HPV6bE7蛋白免疫新西蘭兔并獲得抗HPV6bE7血清，進(jìn)一步純化為HPV6bE7多克隆抗體IgG。采用免疫印跡及免疫熒光法分析該抗體的效價(jià)及特異性。分離正常包皮及尖銳濕疣組織的角質(zhì)形成細(xì)胞采用改良法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，提取的細(xì)胞DNA經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行HPV型別鑒定。
　　 結(jié)果：

5、
　　 一、GST-HPV6bE7融合蛋白的誘導(dǎo)、HPV6bE7蛋白純化及鑒定
　　 將pGEX-4T-2/HPV6bE7原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸埃希菌DH5α經(jīng)0.2mMIPTG誘導(dǎo)、28℃培養(yǎng)4hr后收集的細(xì)菌裂解上清，用12％SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后觀察發(fā)現(xiàn)：在分子量37KD處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與GST-HPV6bE7蛋白預(yù)期分子量相符。將鑒定有GST-HPV6bE7蛋白的超聲粉碎上清液經(jīng)

6、親和層析柱、凝血酶酶切及透析純化后，用15％SDS-PAGE凝膠電泳分析顯示：在分子量14KD處出現(xiàn)有明顯的蛋白條帶，與HPV6bE7蛋白預(yù)期分子質(zhì)量相符。
　　 二、HPV6bE7蛋白兔多克隆抗體的制備、鑒定、純化及效價(jià)分析
　　 將HPV6bE7蛋白免疫接種兔的血清與HPV6bE7蛋白抗原進(jìn)行雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，兩孔之間出現(xiàn)沉淀線，得血清效價(jià)達(dá)1:8。獲得的血清進(jìn)一步純化，所得的抗HPV6bE7多克隆兔抗體IgG經(jīng)免疫

7、印跡鑒定發(fā)現(xiàn)，在分子量約14KD處出現(xiàn)一特異性條帶，與HPV6bE7蛋白大小相符，且無雜帶，說明該多克隆抗體IgG能特異的識別HPV6bE7蛋白，且IgG抗體效價(jià)超過1:5，000。
　　 三、HPV6bE7多克隆抗體IgG的免疫印跡及免疫熒光鑒定
　　 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GFP/HPV6bE748h后的HEK293T細(xì)胞經(jīng)裂解后，蛋白提取液行HPV6b型E7蛋白兔多克隆抗體IgG的免疫印跡鑒定，結(jié)

8、果顯示在分子量約為41KD處有一特異性條帶，與GFP-HPV6bE7融合蛋白大小相符。提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞有HPV6bE7表達(dá)，并被HPV6bE7多克隆抗體IgG特異性識別。
　　 成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GFP/HPV6bE7的HEK293T及B16細(xì)胞行免疫熒光鑒定，結(jié)果顯示HPV6b型E7蛋白兔多克隆抗體IgG可特異性識別轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)的HPV6bE7蛋白。
　　 四、尖銳濕疣組織的角質(zhì)形成細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒

9、定
　　 分離正常包皮及尖銳濕疣組織的角質(zhì)形成細(xì)胞并采用改良法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，成功培養(yǎng)出原代人角質(zhì)形成細(xì)胞，經(jīng)人乳頭瘤病毒核酸擴(kuò)增分型檢測試劑盒型別鑒定，尖銳濕疣組織來源的角質(zhì)形成細(xì)胞有HPV基因表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功表達(dá)并純化了大量可溶性HPV6bE7蛋白。
　　 2、免疫新西蘭兔獲得抗HPV6bE7蛋白多克隆抗血清，成功獲得并純化HPV6bE7多克隆抗體IgG。
　　 3、經(jīng)免