黃精總皂苷的提取條件的優(yōu)化及其對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)的影響和及其可能機(jī)制.pdf

1、目的：1.優(yōu)化黃精總皂苷的提取工藝及測(cè)定經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂(D101)洗脫得到的黃精總皂苷的含量。
　　 2.通過(guò)建立慢性應(yīng)激抑郁大鼠模型，觀察優(yōu)化提取得到的黃精總皂苷(saponins of rhizoma polygonati，SRP)對(duì)抑郁模型大鼠行為學(xué)和海馬、大腦皮層和下丘腦內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)目，及海馬和大腦皮層內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF) 及其受體酪氨酸激酶B

2、(tyrosine kinase B，TrkB)表達(dá)的影響，探討SRP抗抑郁可能的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.稱(chēng)取黃精生藥材，在提取時(shí)間為2小時(shí)，提取次數(shù)為2次，料液比為1:15的基礎(chǔ)上，設(shè)置多指標(biāo)、多因素L9(34)正交試驗(yàn)。擬定影響提取效果的三個(gè)主要影響因素，即：A(溫度)、B(乙醇濃度)、C(pH)為優(yōu)選因素，每個(gè)因素設(shè)定三個(gè)水平A(40℃、60℃、80℃)、B(70％、75％、80％)、C(8、7、6)。

3、采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總皂苷的含量為指標(biāo)，優(yōu)化SRP的提取條件。以薯蕷皂苷為對(duì)照品，在546nm處，采用香草醛-高氯酸比色法測(cè)定總皂苷的含量。以得到SRP的提取優(yōu)化條件。在優(yōu)化的提取方案的條件下提取的乙醇浸膏苷用蒸餾水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇過(guò)大孔樹(shù)脂D101，收集30％乙醇、50％乙醇、75％乙醇洗脫液，減壓濃縮得SRP，測(cè)其SRP的含量。
　　 2.采用孤養(yǎng)加長(zhǎng)期不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激(d1～d21

4、)的方法建立慢性應(yīng)激抑郁大鼠模型，以SRP(30，60，120 mg·kg-1，ig，d1～d21)治療給藥，氟西汀(Fluoxetine，F(xiàn)lu)(2mg·kg-1，ig，d1～d21)作為陽(yáng)性對(duì)照。正常組和模型組給予等體積的羧甲基纖維素鈉溶液。
　　 分別稱(chēng)取各組大鼠在實(shí)驗(yàn)第1天和第21天的體重，實(shí)驗(yàn)第21天體重減去實(shí)驗(yàn)第1天體重為各組大鼠的體重增長(zhǎng)值；通過(guò)大鼠自主活動(dòng)程序儀、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、測(cè)定大鼠糖水?dāng)z入量及懸尾

5、不動(dòng)時(shí)間來(lái)觀察大鼠行為學(xué)的變化。
　　 采用HE染色來(lái)觀察大鼠海馬、大腦皮層和下丘腦內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)目的變化；采用免疫組化法測(cè)定大鼠海馬和大腦皮層內(nèi)BDNF和及TrkB的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.提取實(shí)驗(yàn)的結(jié)果
　　 從正交試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，各因素對(duì)SRP的提取率影響不同，各處理組合極差順序?yàn)镽B>RA>RC，即影響最大的是溶劑乙醇的濃度，其次是溫度和pH。最優(yōu)提取方案應(yīng)為A2B2C3，即乙醇濃度為7

6、5％，溫度為60℃，pH=6；在優(yōu)化的提取方案的條件下提取并經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂洗脫得到的SRP的含量為51.8％。
　　 2.SRP的藥效實(shí)驗(yàn)的結(jié)果
　　 2.1 SRP對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠體重的影響
　　 實(shí)驗(yàn)的第1天，各組大鼠體重比較差異無(wú)顯著性；實(shí)驗(yàn)的第21天，與正常組大鼠相比，模型組大鼠體重增長(zhǎng)值明顯減少；與模型組大鼠相比，SRP(30，60，120 mg·kg-1)組大鼠體重增長(zhǎng)值均有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

7、br>　　 2.2SRP對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為學(xué)的影響
　　 (1)模型組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)明顯少于正常組；與模型組比較，SRP(30，60，120 mg·kg-1)組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)均有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)模型組大鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)于正常組；與模型組比較，SRP(30，60，120 mg·kg-1)組大鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間均有縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (3)模型組大鼠糖水?dāng)z入量較正常組明顯減少

8、；與模型組比較，SRP(30，60，120 mg·kg-1)組大鼠的糖水?dāng)z入量均有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (4)在定位航行試驗(yàn)的第4天，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于正常組；與模型組相比，SRP(30，60，120 mg·kg-1)組大鼠的逃避潛伏期均有縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在空間探索試驗(yàn)中，模型組大鼠在原平臺(tái)象限的搜索時(shí)間明顯長(zhǎng)于正常組；與模型組相比，SRP(30，60，120 mg·kg-1)組大鼠在原平臺(tái)象限的搜

9、索時(shí)間均有所縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.3 SRP對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬、大腦皮層和下丘腦內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)目的影響
　　 模型組大鼠海馬和大腦皮層內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)目明顯低于正常組大鼠；與模型組相比，SRP(30，60，120 mg·kg-1)組大鼠海馬和大腦皮層內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)目均有升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 各組下丘腦內(nèi)幾乎無(wú)神經(jīng)元細(xì)胞，有較多的淋巴細(xì)胞、星形細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 2.4 SRP對(duì)慢

10、性應(yīng)激抑郁大鼠海馬、大腦皮層內(nèi)BDNF和TrkB表達(dá)的影響
　　 與正常組相比，模型組大鼠海馬、大腦皮層內(nèi)BDNF和TrkB免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量減少，平均灰度值較低，差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)。Flu組和SRP(30，60，120 mg·kg-1)組大鼠海馬、大腦皮層內(nèi)BDNF免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加，平均灰度值明顯增高，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)；Flu組大鼠海馬各區(qū)BDNF

11、和TrkB免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量也有明顯的增多，平均灰度值增高，與模型組相比差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)。
　　 大腦皮層各斷面均可見(jiàn)到BDNF和TrkB染色陽(yáng)性細(xì)胞，多見(jiàn)于皮質(zhì)Ⅱ～Ⅵ層，染色反應(yīng)較強(qiáng)，細(xì)胞輪廓清晰，陽(yáng)性顆粒位于胞質(zhì)和突起內(nèi)。以及集中于海馬CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞和齒狀回顆粒細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各因素對(duì)SRP的提取率影響是不均等的，影響最大的

12、是乙醇濃度，其次是溫度和pH。最佳提取工藝為：在提取時(shí)間為2小時(shí)，提取次數(shù)為2次，料液比為1:15的基礎(chǔ)上，提取溶劑乙醇的濃度為75％，溫度：60℃，pH=6。
　　 2.SRP可以改善慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的抑郁樣行為，如自主活動(dòng)次數(shù)減少、糖水?dāng)z入量減少、懸尾不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)及學(xué)習(xí)記憶能力下降等，提示SRP可能具有一定的改善抑郁癥狀的作用。
　　 3.SRP能有效地抑制海馬細(xì)胞表達(dá)BDNF和TrkB的降低，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增