黃芪總皂苷的微生物轉(zhuǎn)化及其條件優(yōu)化的研究.pdf

1、病毒性心肌炎是心臟病的主要病種之一。黃芪注射液作為臨床治療病毒性心肌炎常用藥已有較長(zhǎng)一段歷史。黃芪甲苷作為黃芪皂苷提取物中主要成分，是治療病毒性心肌炎的主要有效成分，其通過(guò)提高血管內(nèi)皮細(xì)胞耐氧，從而減少由于缺氧引發(fā)的損傷，達(dá)到保護(hù)受損心臟，減輕癥狀等目的。由中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)研制申報(bào)的中藥一類注射劑——黃芪甲苷氯化鈉注射液等，已進(jìn)入冠心病心絞痛臨床Ⅱ期試驗(yàn)階段。
　　 黃芪甲苷還具有保肝，延緩衰老等諸多藥理作用。在最近幾

2、年的研究中，黃芪甲苷的抗乙肝病毒活性被發(fā)現(xiàn)，而且效果顯著（體外試驗(yàn)效果優(yōu)于臨床常用藥物拉米夫定）。
　　 黃芪甲苷的制備仍然以中藥藥材黃芪中分離提取為主，不同產(chǎn)地黃芪中黃芪甲苷含量差異較大，以甘肅、內(nèi)蒙古等區(qū)域品種含量較高。通過(guò)大孔樹(shù)脂吸附法、正丁醇萃取法等只獲取黃芪皂苷提取物中黃芪甲苷部分，剩余皂苷中仍有較多結(jié)構(gòu)與黃芪甲苷相似的皂苷，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，因此，有必要開(kāi)發(fā)一種通過(guò)改造結(jié)構(gòu)相似的黃芪皂苷而提高黃芪甲苷含量的新方

3、法。
　　 黃芪皂苷提取物中，黃芪甲苷為主要成分，已報(bào)道的其他成分包括有黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、異黃芪皂苷Ⅲ等[1-4]，其中黃芪皂苷Ⅲ、異黃芪皂苷Ⅲ等在理論上通過(guò)水解得到黃芪甲苷，由于可水解的原料較多，化學(xué)轉(zhuǎn)化較困難，所以生物酶法轉(zhuǎn)化成為一種可行的研究切入點(diǎn)。
　　 生物轉(zhuǎn)化是提高黃芪總皂苷中黃芪甲苷含量的有效方法，但是也遇到了些問(wèn)題，比如轉(zhuǎn)化專一性差等，轉(zhuǎn)化得到黃芪甲苷的效率相

4、對(duì)較低，仍難以實(shí)現(xiàn)達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的目的。而且通過(guò)生物合成方法提高產(chǎn)物含量，菌種是關(guān)鍵。在已有的報(bào)道中，僅有一組相關(guān)研究是利用Absida sp.A3r等[5-10]菌株產(chǎn)生的糖苷酶提高黃芪甲苷含量。鑒于此種方法，我們使用微生物轉(zhuǎn)化為途徑，通過(guò)誘變技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改造，從而克服遇到的難題，努力實(shí)現(xiàn)黃芪甲苷的產(chǎn)業(yè)化。
　　 本研究通過(guò)對(duì)復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存菌株進(jìn)行研究，篩選能夠轉(zhuǎn)化黃芪總皂苷到黃芪甲苷，并且產(chǎn)物專一，轉(zhuǎn)化率較高的菌種，最

5、終發(fā)現(xiàn)傘枝犁頭霉具有較好的轉(zhuǎn)化能力，并以之作為始發(fā)菌種，通過(guò)UV、DES、NTG誘變育種，篩選出能夠高效提高黃芪甲苷在黃芪總皂苷中含量的菌種，使黃芪甲苷的產(chǎn)率從28.3％增加至31.1％。
　　 通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基碳源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源、金屬離子及其他組分單因素考察，利用正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，黃芪甲苷的產(chǎn)率提高至38.15％。再通過(guò)對(duì)pH、生長(zhǎng)時(shí)間、底物誘導(dǎo)劑量、投料時(shí)間、發(fā)酵時(shí)間、底物投料劑量、底物溶媒、裝液量、

6、接種量以及發(fā)酵溫度等培養(yǎng)條件優(yōu)化，搖瓶試驗(yàn)結(jié)果顯示，在底物投料量為15 mg/mL時(shí)，黃芪甲苷最高產(chǎn)率可以達(dá)到42.86％。
　　 在對(duì)產(chǎn)物提取方法進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷主要分布在發(fā)酵液當(dāng)中，菌絲也有極微量產(chǎn)物，利通大孔吸附樹(shù)脂洗脫除去產(chǎn)物中的糖類，酮類等雜質(zhì)，使用硅膠柱層析方法對(duì)濃縮后的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，重結(jié)晶得到的了含量為95％的黃芪甲苷單體，建立了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模純化制備黃芪甲苷的有效方法，并通過(guò)1H、13C-NMR以及HPL