昆布多糖對(duì)單核細(xì)胞源性樹突狀細(xì)胞成熟和功能的影響.pdf

1、目的：
　　 通過氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）誘導(dǎo)單核細(xì)胞源性樹突狀細(xì)胞(DC)成熟，昆布多糖干預(yù)培養(yǎng)，了解昆布多糖對(duì)單核細(xì)胞源性DC成熟和功能的影響；進(jìn)一步探討昆布多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.采用密度梯度離心法分離出正常人外周血單核細(xì)胞,經(jīng)由含重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF，20ng/ml）和重組人白介素4(rh IL-4，20ng/ml)的D

2、C無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)至第5天分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入OX-LDL(100μg/ml)，對(duì)照組加入PBS。鏡下觀察DC形態(tài)變化,培養(yǎng)至第7天收集DC細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表型(CD1a，CD80,CD86，HLA-DR)的表達(dá)。
　　 2.采用密度梯度離心法分離出正常人外周血單核細(xì)胞,經(jīng)由含重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF，20ng/ml）和重組人白介素4(rh IL-4,20ng/ml)的DC無

3、血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)至第五天均加入OX-LDL(100μg/ml)。第6天將實(shí)驗(yàn)組分成三組，分別加入昆布多糖5μg/ml，2.5μg/ml，0.5μg/ml；對(duì)照組加入PBS。待DC與昆布多糖共同孵育24h后,鏡下觀察DC形態(tài)變化,同時(shí)收集DC細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表型(CD1a，CD86,TLR-2)的表達(dá)。收集細(xì)胞上清液IL-12進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。
　　 結(jié)果：
　　 1.1 DCs形態(tài)學(xué)觀察

4、：培養(yǎng)72小時(shí)后，細(xì)胞部分在培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞較小，形態(tài)無明顯差別，部分外形發(fā)生改變，邊緣不規(guī)則。第5天后，細(xì)胞開始懸浮生長(zhǎng)。培養(yǎng)第7天，大部分細(xì)胞懸浮，體積較大，形狀不規(guī)則，并且有毛刺狀突起，部分聚集成團(tuán)，PBS組和OX-LDL組間外形上無明顯差別。
　　 1.2 DCs表型變化：收集兩組細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞表型檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間表型表達(dá)具有差異。與PBS對(duì)照組相比，ox-LDL實(shí)驗(yàn)組的DC表型CD1a、CD80、CD8

5、6、HLA-DR的表達(dá)均上調(diào)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　 2.1 DCs形態(tài)學(xué)觀察：培養(yǎng)第2天細(xì)胞大多粘附于聚乙烯培養(yǎng)瓶底，少量懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞較小，形態(tài)無明顯差別；培養(yǎng)至72小時(shí)后，細(xì)胞部分在培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞較小，形態(tài)無明顯差別，部分外形發(fā)生改變，邊緣不規(guī)則。培養(yǎng)第6天細(xì)胞大部分懸浮，部分聚集成簇細(xì)胞表面可見數(shù)量不等，形態(tài)不一的樹突樣突起。第7天，對(duì)照組生長(zhǎng)狀態(tài)最好，大多聚集成團(tuán)，樹突狀突起明顯增多，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞

6、與前一天無明顯差異，各組間亦無明顯的外形差異。
　　 2.2 昆布多糖對(duì)DCs表型的影響：收集干預(yù)24h的懸浮細(xì)胞,經(jīng)FACS分析顯示，經(jīng)昆布多糖干預(yù)后，DC表面分子TLR2的表達(dá)增加，對(duì)照組TLR2的表達(dá)為(22.65±4.9)％；實(shí)驗(yàn)組第一、二、三組分別為：(33.06±0.91)％，(29.88±2.53)％，(27.94±1.40)％。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異有顯著性（P<0.05），5μg/ml組與0.5μg/ml組之間

7、差異有顯著性（P<0.05）。CD1a、CD86的表達(dá)下調(diào)，且各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 2.3 參與實(shí)驗(yàn)的所有樣本都收集細(xì)胞上清液IL-12進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。培養(yǎng)到第7天后，4組細(xì)胞上清液中IL-12含量存在顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）；各組細(xì)胞上清液中IL-12含量分別均存在顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）。PBS 組IL-12含量高于各實(shí)驗(yàn)組。
　　 結(jié)論：