人骨髓間充質(zhì)干細胞抑制單核細胞來源的樹突狀細胞的成熟和功能.pdf

1、間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，MSC)是近年發(fā)現(xiàn)的來源于中胚層的一類非造血成體干細胞，具有干細胞的共性：高度自我更新和多向分化能力。由于其具有低免疫原性、促進造血重建、免疫調(diào)節(jié)等特性，成為一類理想的移植備選干細胞。MSC的免疫調(diào)節(jié)是目前移植領(lǐng)域研究的新熱點，但其作用機制目前尚不十分明確。樹突狀細胞(dendriticcells，DC)是體內(nèi)功能最為強大的一類抗原呈遞細胞，它可以激活初始型T淋巴細胞(naiveT

2、cells)，是免疫應(yīng)答的始動因素，在免疫應(yīng)答中處于重要的地位。DC對造血干細胞移植后移植物抗宿主病(graftversushostdisease,GVHD)的發(fā)生及耐受中起著雙向調(diào)節(jié)作用，研究間充質(zhì)干細胞對DC的作用機制對移植免疫有重大意義，將為防治異基因造血干細胞移植中移植物抗宿主病提供可能途徑。國內(nèi)外研究集中在間充質(zhì)干細胞對DC亞群、成熟程度及分泌細胞因子的影響，其機制仍有爭議。本實驗旨在研究間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清對DC成熟程度及分

3、泌細胞因子的影響，進而探討間充質(zhì)干細胞防治GVHD的機制，為其臨床應(yīng)用提供實驗資料。 材料和方法： 1.間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 取健康成人骨髓，以密度梯度離心法分離單個核細胞，用含15％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，取第5代細胞以FITC標記的鼠抗人CD29、CD44、CD34、CD45單克隆抗體流式細胞儀鑒定表型。 2.單核細胞來源的人樹突狀細胞的誘導及鑒定 取健康成人外周血Fi

4、coll密度梯度離心法收獲單個核細胞，用含10％胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育兩小時后棄去非貼壁細胞，加含IL-4(10ng/ml)、GM-CSF(10ng/ml)的10％胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，部分細胞第5天加入LPS(100ng/ml)、TNF-a(10ng/ml)促其成熟，第7天收獲懸浮細胞。以FITC、PE標記的鼠抗人CD1a、CD80、CD83、HLA-DR單克隆抗體流式細胞

5、儀鑒定第5天、第7天DC免疫表型。 3.樹突狀細胞流式細胞儀鑒定表型變化 部分培養(yǎng)第5天的細胞收獲后，以每孔1×106密度種于24孔培養(yǎng)板，分為單獨培養(yǎng)組和混合培養(yǎng)組，加LPS(100ng/ml)、TNF-a(10ng/ml)促DC成熟，混合培養(yǎng)組另加入等體積3-6代MSC上清混合培養(yǎng)，48小時后收獲DC鑒定表型。 4.IL-10、IL-12濃度測定 分別取3-6代MSC上清、單獨培養(yǎng)組第7天DC上清、混

6、合培養(yǎng)組第7天DC上清，每組設(shè)5個復孔，ELISA試劑盒分別測定其IL-10、IL-12濃度。 5.四甲基偶氮唑鹽光吸收法(MTT法)測定刺激淋巴細胞反應(yīng) 將異基因淋巴細胞以每孔2×105個細胞置于96孔板，收獲單獨培養(yǎng)組第7天DC、混合培養(yǎng)組第7天DC，分別以1∶40、1∶20、1∶10的比例加入單獨培養(yǎng)組DC和混合培養(yǎng)組DC，每組設(shè)5個復孔，37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育72小時，終止前4小時加入MTT。 6.所

7、得結(jié)果應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件處理，統(tǒng)計學數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s表示)。兩樣本均數(shù)的比較采用獨立樣本的T檢驗，以α=0.05作為檢驗水準。 結(jié)果 1.MSC的鑒定：取培養(yǎng)至第5代MSC，流式細胞儀鑒定表型，表達CD29、CD44，不表達CD34、CD45造血干祖細胞標記，結(jié)合細胞形態(tài)及培養(yǎng)特性證實所培養(yǎng)細胞為間充質(zhì)干細胞。 2.DC的鑒定：從外周血獲取的PBMC貼壁兩小時后，獲得的貼壁細胞為單核細胞，培

8、養(yǎng)第2天細胞開始變形，第3天有部分細胞開始懸浮，第7天大部分細胞懸浮不貼壁，懸浮細胞有樹突狀突起呈星形或幕形，流式細胞儀鑒定表型，第五天DC高HLA-DR，低表達CD1a、CD80、CD83，第7天DCCD1a、CD80、CD83表達明顯升高，經(jīng)TNF-a、LPS刺激大量分泌IL-12，能顯著刺激異基因淋巴細胞增殖反應(yīng)。 3.MSC上清作用后DC免疫表型的變化：與3-6代間充質(zhì)干細胞上清等體積作用48小時，加LPS(100ng/

9、ml)、TNF-a(10ng/ml)刺激成熟，與成熟樹突狀細胞相比，CD1a、CD80、CD83表達明顯降低，HLA-DR無明顯變化，免疫表型符合不成熟DC。 4.IL-10、IL-12濃度測定：3-6代MSC上清ELISA法測定不分泌IL-10、IL-12，成熟DC大量分泌IL-12(356.25±24.24pg/ml)，IL-10未測到，與MSC上清混合培養(yǎng)的DC分泌IL-12明顯減低(207.5±13.63pg/ml)，減

10、少41.7％(p＜0.05)，IL-10未有變化。 5.刺激淋巴細胞反應(yīng)：成熟DC具有很強的刺激淋巴細胞增殖的能力，且與DC數(shù)量成線性關(guān)系，而混合培養(yǎng)DC刺激能力明顯降低，單獨培養(yǎng)組DC和混合培養(yǎng)組DC在1∶40、1∶20、1∶10三個比例組均有顯著性差異(p＜0.05)。 結(jié)論 1.建立了骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定方法，為間充質(zhì)干細胞基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供了可行條件。 2.間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清抑