L選擇蛋白介導(dǎo)人單核細(xì)胞源性樹突狀細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用.pdf

1、背景:以動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)為基礎(chǔ)的心、腦血管疾病是現(xiàn)代社會(huì)病死率和致殘率最高的疾病，嚴(yán)重降低人們的生活質(zhì)量，因此針對AS的發(fā)生機(jī)制，預(yù)防和控制AS發(fā)生和發(fā)展已成為心血管疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來先后有學(xué)者提出脂質(zhì)沉積學(xué)說，單克隆學(xué)說、血小板聚集學(xué)說和炎癥細(xì)胞浸潤學(xué)說，但均不能解釋AS的全過程。Ross于1999年大膽提出AS是一種炎癥免疫性疾病，并得到學(xué)術(shù)界的普遍認(rèn)可，為動(dòng)脈粥樣硬化的病因研究、預(yù)

2、防和治療帶來了革命性影響。
　　 樹突狀細(xì)胞(Dendriticcell，DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的專職性抗原提呈細(xì)胞(Antigenpresentationcell，APC)，是唯一能有效激活初始型T細(xì)胞的APC，是機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)的始動(dòng)者。未成熟DCs的生理功能主要是對抗原的的攝取、加工及較強(qiáng)的遷移能力，但因其細(xì)胞表面不具有高水平的MHCⅡ類分子和共刺激分子，只能較弱的激活T細(xì)胞。與之相反，成熟DCs能激活初始型T細(xì)胞并

3、啟動(dòng)免疫反應(yīng)。1995年Bobryshev首次發(fā)現(xiàn)了樹突狀細(xì)胞存在于正常動(dòng)脈管壁中，并將這類DCs命名為血管樹突狀細(xì)胞(VDC)。研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中樹突狀細(xì)胞數(shù)量明顯多與正常動(dòng)脈管壁，提示DCs可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。在AS形成的早期，單核細(xì)胞的浸潤可致血源性的樹突狀細(xì)胞數(shù)量增多并被活化，促進(jìn)其發(fā)育為成熟DCs。有學(xué)者證實(shí)，不穩(wěn)定斑塊中的DCs多于穩(wěn)定斑塊中的DCs，并推測DCs存在于斑塊中的數(shù)量和部位與斑塊的穩(wěn)

4、定性密切相關(guān)。Toll樣受體4因其大量存在于DCs表面，并通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最終導(dǎo)致核因子-κB(NF-κB)和免疫反應(yīng)基因的激活，引起炎癥因子和趨化因子的分泌，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的的發(fā)生和發(fā)展。
　　 L-選擇蛋白是細(xì)胞黏附分子選擇素家族中的一員，主要參與炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答時(shí)白細(xì)胞的滾動(dòng)和粘附。研究證實(shí)，樹突狀細(xì)胞表面存在L-選擇蛋白的主要配體sleX、MadCAM。研究表明，不穩(wěn)定心絞痛患者其血清中L-選擇蛋白較穩(wěn)定性心絞痛患者和正常人

5、水平明顯升高，提示L-選擇蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附和炎癥反應(yīng)與斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)。Allan在心肌缺血模型中證實(shí)了L-選擇蛋白單克隆抗體可使心肌壞死減少60％。因此，我們大膽推測L選擇蛋白通過TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)DCs成熟并參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。
　　 目的:在離體細(xì)胞水平觀察L-選擇蛋白對人單核細(xì)胞源性樹突狀細(xì)胞分化及免疫功能的影響并進(jìn)一步探討其發(fā)生機(jī)制。
　　 方法:采用健康人外周血經(jīng)免疫磁珠方法分離出CD14

6、+單核細(xì)胞，加入重組人GM-CSF和IL-4細(xì)胞因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞定向分化為DCs。DCs在培養(yǎng)基中孵育5天，收集并隨機(jī)分為四組。分別為與脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、L選擇蛋白、L選擇蛋白抑制劑及不加任何刺激因子的DCs孵育24-36小時(shí)，電鏡下觀察四組DCs形態(tài)變化、流式細(xì)胞儀檢測免疫表型CD1a、CD80、CD83、CD86表達(dá)的變化，提取總RNA，采用RT-PCR檢測TLR4mRNA;流式細(xì)胞儀檢測四組

7、TLR4蛋白表達(dá)率。
　　 結(jié)果:經(jīng)L選擇蛋白刺激后的DCs胞體變大，呈不規(guī)則形，細(xì)胞表面有很多且長的突起，胞質(zhì)豐富，胞漿中細(xì)胞器較未成熟組少。而未成熟組DCs胞體較小，外形較規(guī)則，未見長的突起。與陰性對照即未成熟組相比，L選擇蛋白組DCs表面抗原CD1a，CD80，CD83，CD86表達(dá)明顯增加。而L選擇蛋白拮抗劑組即Fucodian組較L選擇蛋白組抗原表達(dá)量有所下調(diào)。L選擇蛋白可以上調(diào)DCs內(nèi)TLR4mRNA的表達(dá)，流式細(xì)胞

8、儀結(jié)果示經(jīng)L選擇蛋白干預(yù)后的DCs較未成熟組表達(dá)TLR4蛋白水平高，且給予L選擇蛋白抑制劑可部分下調(diào)DCs表面表達(dá)TLR4。
　　 結(jié)論:L選擇蛋白與樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)后能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟并表達(dá)高水平的共刺激分子CD1a、CD80、CD83、CD86;RT-PCR結(jié)果和流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示L選擇蛋白能上調(diào)TLR4表達(dá)，而L選擇蛋白拮抗劑能部分下調(diào)上述結(jié)果。我們推測L選擇蛋白與樹突狀細(xì)胞表達(dá)的配體相結(jié)合后通過TLR4通路促進(jìn)DCs成