肝癌靶向性N-ras反義表達載體的構(gòu)建及對人肝癌細胞系BEL-7402作用的研究.pdf_第1頁
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1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文肝癌靶向性Nras反義表達載體的構(gòu)建及對人肝癌細胞系BEL7402作用的研究姓名:孔建平申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):免疫學(xué)指導(dǎo)教師:孫汶生2001.5.20山東大學(xué)碩士論文酶切鑒定插入方向,并進行DNA測序和同源性分析。以陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組反義核酸表達載體轉(zhuǎn)染受體細胞BEL一7402,并經(jīng)潮霉素B(100“g/m1)篩選,對抗性克隆擴增培養(yǎng),從而建立了Nras表達阻斷的穩(wěn)定的HygB抗性肝癌細胞株。通過流式細胞儀分

2、析,測定反義核酸對肝癌細胞靶基因表達、細胞周期的分布及細胞凋亡的影響。結(jié)果:將106kb的NraseDNA片段和去磷酸化修飾的載體pEBAF進行連接轉(zhuǎn)化,隨機小量擴增抽提質(zhì)粒,經(jīng)BamHI酶切,電泳證實目的基因成功插入。以隨機引物法制備的地高辛標記N—raseDNA探針,其靈敏度測定為lpg。菌落原位雜交結(jié)果亦證實連接成功。載體pEBAF在NraseDNA插入位點下游125bp處有一PvuII切點,而Nras57端275bp處亦有同一酶

3、切位點。對初篩陽性克隆用PvuII酶切鑒定,電泳如見到900bp和156kb為正向插入,如見到400bp和16Ikb為反向插入。兩者分別命名為pEBhF/sNras和pEBAF/as—Nras。將p朗AF/as—N—ras進行測序和同源性分析,結(jié)果顯示該序列包括NraseDNA蛋白全部編碼區(qū)及其兩側(cè)部分具有轉(zhuǎn)錄和表達調(diào)控功能的非編碼序列,其中57端為61bp,37端為378bp。轉(zhuǎn)染反義表達載體pEBAF/as—N—ras的肝癌細胞N一

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