土槿皮乙酸對(duì)肝癌BEL-7402細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響.pdf

1、目的：土槿皮乙酸(pseudodaric acid-B,PAB)是從我國(guó)的松科植物會(huì)錢松(PseudolarixKaempferi Gord)的根皮及近根皮中分離出來(lái)的二萜類化合物,為一種單體成分。土槿皮乙酸傳統(tǒng)上是作為一種抗真菌藥物,后來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有抗生育、抗血管生成和抗腫瘤作用。研究證明PAB可以抑制胃癌、肺癌、肝癌、宮頸癌白血病等多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與清除氧自由基,作用于細(xì)胞周期集細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶,

2、影響p53、Bcl-2家族、Caspase激活,影響與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路等有關(guān)。雖然近年來(lái),多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)對(duì)PAB抗腫瘤的作用機(jī)制進(jìn)行了一定的研究,而且土槿皮乙酸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡確實(shí)有影響,但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)PAB對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移作用的報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)將探討研究土槿皮乙酸對(duì)人肝癌BEL-7402細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。,以為進(jìn)一步開發(fā)治療肝癌的新藥提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)：人肝癌細(xì)胞株BEL

3、-7402由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院傳染科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng),在含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、飽和濕度,飽和溫度為37℃,CO2濃度為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2.MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖：人肝癌細(xì)胞株BEL-7402細(xì)胞密度調(diào)整為5×104/L,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100μl。培養(yǎng)12小時(shí)后分別加入含不同濃度PAB的培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)24,48,72h,應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)各孔吸光度值(OD值),計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。<

4、br>　　 3.Transwell檢測(cè)PAB對(duì)BEL-7402細(xì)胞侵襲能力的影響：冰上1:10稀釋過夜解凍的Matrigel膠并鋪至Transwell小室內(nèi)部的膜上。取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),打勻的細(xì)胞懸液加入Transwell小室,同時(shí)加入0.5μmol·L-1PAB,我選擇的PAB濃度是用MTT篩選出的72h的IC50,以血清濃度差作為趨化條件,小室內(nèi)為含1％血清的培養(yǎng)基,下室為含30％血清的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)后予甲醇固定

5、,姬姆薩染色,取膜,封片,鏡檢。細(xì)胞計(jì)數(shù),倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(400*)計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù),取均數(shù)。
　　 4.Transwell檢測(cè)PAB對(duì)BEL-7402細(xì)胞遷移能力的影響：體外轉(zhuǎn)移能力的測(cè)定時(shí)Transwell小室的濾膜不用Matrigel膠覆蓋。方法同Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以(-X)±S表示,采用t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　

6、1.PAB對(duì)BEL-7402細(xì)胞增殖的影響不同濃度PAB(0.5,1.0,2.0,4.0)作用相同時(shí)間,隨著藥物濃度的增加,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率增加,相同濃度PAB作用不同時(shí)間(24,48,72h),隨著時(shí)間的增加,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率增加。表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性和時(shí)間依賴性(P＜0.05),0.5μmol·L-1PAB作用24小時(shí),對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。
　　 2.PAB對(duì)BEL-7402細(xì)胞侵襲遷移能力的影響PAB組遷移與侵襲細(xì)

7、胞數(shù)明顯低于對(duì)照組,對(duì)照組細(xì)胞輪廓清晰,活力旺盛,PAB組細(xì)胞明顯變圓,稀疏。PAB組遷移與侵襲能力較對(duì)照組下降,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示PAB對(duì)于肝癌BEL-7402細(xì)胞的遷移能力有明顯的抑制作用。
　　 結(jié)論：土槿皮乙酸作用后肝癌細(xì)胞粘附率較對(duì)照組明顯下降(p＜0.05),呈時(shí)間和濃度依賴性,土槿皮乙酸作用后肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯下降(p＜0.05)。研究結(jié)果表明土槿皮乙酸能抑制肝癌細(xì)胞增殖,降低