青藤堿關節(jié)腔注射對骨關節(jié)炎兔細胞因子及軟骨結構的影響.pdf

1、目的及意義： 骨性關節(jié)炎(OA)是一種關節(jié)軟骨退變和關節(jié)周圍形成骨質增生為病理特征的慢性進行性骨關節(jié)病，是影響人類健康最常見的關節(jié)疾患之一，是導致50歲以上人群功能殘疾、造成經濟損失和影響社會發(fā)展的主要疾病之一。國內統(tǒng)計資料表明，我國患有OA的人數(shù)占總人口的3％，其中大部分為膝OA，55歲人群以上X線上有膝OA表現(xiàn)者約60％，65 歲以上老年人X線上有膝OA的發(fā)病率可達85％，目前我國正在步入人口老齡化國家的行列，因而OA的發(fā)病

2、率將有增無減，可見其影響巨大，正因為如此目前該病正成為大家關注的熱點。 骨關節(jié)炎的治療目標是控制疼痛、改善關節(jié)功能和生活質量，抑制疾病的進程，盡可能避免治療的毒副作用。西醫(yī)學根據(jù)OA的發(fā)病機理，研究了許多新型藥物及方法治療OA，并取得顯著進展，同時提出了今后研究策略。目前在OA的治療方面對抑制整個疾病的進程的藥物(如補充軟骨基質成分的氨基葡萄糖、IL-1 抑制劑雙醋瑞因、有提高滑液質量并保護軟骨的透明質酸)的研究較多，但是因為價

3、格均較貴、起效也較慢而限制了它們的應用。 中醫(yī)學認為，骨性關節(jié)炎屬于“痹證”、“骨痹”范疇?！端貑枴け哉摗吩唬骸帮L寒濕三氣雜至，合而為痹也。五臟皆有合，病久而不去者，內舍于其合也。故骨痹不已，復感于邪，內舍于腎?！憋L寒濕邪侵襲及跌仆扭傷為發(fā)病誘因，肝腎虧虛是本病發(fā)病基礎，也是疾病繼續(xù)發(fā)展的結果，故本病的治則：祛風散寒除濕止痛，補益肝腎。青風藤為防已科植物青藤的干燥根莖，苦、辛、平稍偏溫。中醫(yī)藥學應用青風藤已有一千多年的歷史效果顯

4、著。清風藤名稱始見于宋·《圖經本草》，蘇頌頌曰：“生臺州天臺山中。其苗蔓延木上，四時常青。土人采莖用……，……治風疾?！本哂徐铒L散寒除濕、通絡止痛的作用。青風藤的主要藥理成分為青藤堿，應用體外酶反應實驗體系，觀察青藤堿對離體環(huán)氧化酶-1(COX-1)和 COX-2純酶活性的影響，結果提示青藤堿選擇性抑制COX-2緩解類風濕性關節(jié)炎(RA)所致的疼痛。也有研究顯示青風藤能顯著增強小鼠非特異性免疫功能，抑制細胞免疫功能，但對體液免疫功能無明

5、顯影響。從細胞因子基因調控研究青藤堿抗炎抗風濕作用機制，發(fā)現(xiàn)青藤堿能通過下調入外周血單個核細胞 IL-1β、IL-8 mR NA表達發(fā)揮對關節(jié)炎的治療作用，從而抑制 RA的發(fā)展進程。目前對青藤堿的研究多集中在類風濕性關節(jié)炎上，使用方法多為口服或肌肉注射，而對于在OA中的治療作用及作用機理的研究、以及對于軟骨細胞組織學和超微結構的改變尚未見報道。本研究擬應用青藤堿注射液給予OA模型動物關節(jié)腔內注射，通過檢測細胞因子 IL-1β、IL-6、

6、TNF-α變化，以及OA關節(jié)軟骨組織學和超微結構的改變，探討青藤堿治療OA的可能機制，為臨床應用青藤堿防治OA尋找和奠定理論基礎。 實驗方法： 本實驗擬應用管型石膏固定制動方法對42只健康日本大耳白兔進行OA造模，將36只模型兔分為3組：青藤堿關節(jié)腔注射治療組、透明質酸組即施沛特關節(jié)腔注射對照組、生理鹽水關節(jié)腔注射組即模型組、另外4只健康兔作為正常對照組不給予任何處理。觀察青藤堿關節(jié)腔注射對OA兔血清及關節(jié)滑液中細胞因子

7、的影響以及對模型兔關節(jié)軟骨組織學和超微結構的改變的影響，探討青藤堿治療OA的作用機制。具體方法如下： 1、兔膝OA模型的建立：管型石膏固定兔左后肢關節(jié)，并在2、4、6周時用耳緣靜脈空氣栓塞法分別處死2只造模兔，觀察兔膝關節(jié)外觀及軟骨大體解剖結構，通過肉眼觀察及按關節(jié)鏡下軟骨破壞分期標準判斷兔膝關節(jié)OA是否建立。 2、細胞因子的檢測：分別在1、2、3、4、5周各給予青藤堿、施沛特、生理鹽水0.2ml關節(jié)腔注射，在治療前及治

8、療5周后分別抽取靜脈血及膝關節(jié)滑液，作血清及膝關節(jié)滑液細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α檢測(試劑由上海西唐公司提供，嚴格按照試劑盒上要求進行操作，IL-1β批號為0510132，IL-6批號為 0510094，TNF-α批號為 0510118)。 3、通過肉眼大體評分對各組實驗組兔關節(jié)軟骨病變的變化進行觀察比較；通過光鏡對各組實驗前后組織形態(tài)學與組化雙染色(HE/safranin O雙染色)進行觀察并按照調整后的關節(jié)軟骨

9、病變的組織學-組織化學 Mankin’s評分進行比較；透射電鏡觀察各組軟骨結構超微結構變化，并對各組進行比較。 結果： 在成功建立兔膝 OA 模型的基礎上，分別給予OA兔關節(jié)腔內注射青藤堿、透明質酸、生理鹽水，發(fā)現(xiàn)青藤堿及透明質酸關節(jié)腔內注射前后血液及關節(jié)腔滑液中細胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α均有明顯下降，治療組與對照組相比差異有顯著性。具體結果如下： 1、兔膝OA模型的建立：健康日本大耳白兔管型石膏

10、固定后，分別在2、4、6周時通過耳緣靜脈注射空氣法各處死2只兔，第2周時肉眼觀察發(fā)現(xiàn)兔膝關節(jié)面欠光滑平整，關節(jié)間隙尚正常、對稱、無軟骨下骨硬化和骨贅形成；第4周時觀察發(fā)現(xiàn)兔膝關節(jié)內側關節(jié)間隙稍變窄，軟骨下骨輕度硬化，密度稍增高，未見明顯骨贅形成；第6周時拆除石膏可發(fā)現(xiàn)兔膝關節(jié)腫大變形，剖開膝關節(jié)可見典型OA表現(xiàn)，關節(jié)面不平整，內側關節(jié)間隙狹窄，軟骨小潰瘍形成，軟骨下骨較硬化，有少許骨贅形成，光鏡組織形態(tài)學與組化染色觀察以及透射電鏡觀察均

11、符合OA的表現(xiàn)。 2、實驗前后細胞因子的變化：①青藤堿組關節(jié)腔內注射前后血液中及關節(jié)滑液中細胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α有明顯變化，同組間相比差異有顯著性(P<0.01=。②透明質酸組關節(jié)腔內注射前后血液中及關節(jié)滑液中細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α有明顯變化，同組間相比差異有顯著性(P<0.05)。③生理鹽水組關節(jié)腔內注射前后血液中及關節(jié)滑液中細胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α無明顯變化，同組間相比

12、差異無顯著性(P>0.05)。④青藤堿組與透明質酸組治療后血液中及關節(jié)滑液中細胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α有明顯變化，青藤堿組明顯優(yōu)于透明質酸組，兩組間相比差異有顯著性(P<0.05)⑤青藤堿組組及透明質酸組治療后血液中及關節(jié)滑液中細胞因子的變化與生理鹽水組相比均有明顯變化，差異有顯著性(P<0.01)。⑥青藤堿組、透明質酸組、生理鹽水三組在治療后和正常D組相比差異均有顯著性(P值分別小于0.05、0.05、 0.01)

13、 3、關節(jié)軟骨結構組織形態(tài)學及超微結構變化： 1)肉眼大體評分：①治療組關節(jié)腔內注射后肉眼觀察關節(jié)軟骨病變的大體評分與生理鹽水組相比有顯著性差異(P<0.05)②對照組關節(jié)腔內注射肉眼觀察關節(jié)軟骨病變的大體評分與生理鹽水組相比有顯著性差異(P<0.05)③治療組與對照組治療后肉眼觀察關節(jié)軟骨病變的大體評分有日月顯變化，治療組明顯優(yōu)對照組，兩組間相比差異有顯著性(P<0.05)；④正常組與治療組、對照組及模型組三組相比差異有顯

14、著性(P<0.05、P<0.05、P<0.01)。 2)組織形態(tài)學與組化染色觀察：治療組關節(jié)軟骨出現(xiàn)裂隙，可達切線層和過渡層，出現(xiàn)了細胞增生或輕度細胞克隆化形成的軟骨細胞簇，有多重潮線，safranin O 染色輕到中度的減少，與模型組相比Mankin’ s評分有顯著性差異。對照組關節(jié)軟骨的裂隙深入放射層，有細胞克隆化形成的軟骨細胞簇，或有細胞減少，有多重潮線和潮線被毛細血管穿破現(xiàn)象，safranin O 染色中到重度的減少，與

15、模型組相比Mankin’s評分有顯著性差異；模型組關節(jié)軟骨的裂隙可達鈣化層，甚至結構被完全破壞，細胞減少，只殘留無細胞的 HE 紅染物質，軟骨下骨增生，safranin O無染色，病變加重明顯；正常組關節(jié)軟骨表面大多完整，軟骨略顯蒼白，稍軟，鏡下見關節(jié)軟骨表面多光滑，細胞正常或有輕度增生，潮線多完整，safranin O染色均勻，與模型組相比Mankin’s評分有顯著性差異。 3)透射電鏡觀察：模型組呈顆粒狀外觀，交鏈現(xiàn)象不明顯

16、；細胞輪廓不清晰，胞核消失，細胞裂解為大量致密的顆粒狀物，有向陷窩一角聚集的傾向。正常組交鏈較為緊密，可見周期性橫紋；細胞呈梭形或橢圓形，胞核完整，核膜清晰，染色質分布均勻，胞漿密度均勻或輕度增加，部分出現(xiàn)空泡，可見內質網(wǎng)、線粒體等細胞器。對照組交鏈出現(xiàn)紊亂；細胞縮小，胞核變形，有分離現(xiàn)象；胞膜出現(xiàn)不連續(xù)現(xiàn)象，胞漿丟失嚴重，可見大量脂滴或囊泡；胞周出現(xiàn)較多致密顆粒。治療組與治療前相比無明顯變化，介于對照組和正常組之間，交鏈出現(xiàn)輕度紊亂，

17、細胞縮小，胞核變形，核膜不很清晰，胞漿開始丟失。 研究結果表明，采用管形石膏制動的方法對健康、成年兔進行膝OA造模，6周后兔膝關節(jié)就出現(xiàn)中重度的退變，具有造模時間短，操作簡單，可重復性強，動物死亡率低等特點，該方法沒有使用任何藥物也沒有其他可能對實驗有影響的因素，而且接近人類的發(fā)病過程，是一個比較好的OA的造摸方法。青藤堿關節(jié)腔內注射對OA兔血液、關節(jié)滑液中的細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α有抑制作用，并且能夠抑制關節(jié)軟