晚期氧化蛋白產(chǎn)物對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨及滑膜影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　1.探討外源性晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織大體形態(tài)的影響。
　　2.探討外源性晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)對(duì)滑膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響。
　　研究方法：
　　1.體外制備AOPPs修飾的兔血清白蛋白(AOPPs-RSA)。
　　將兔血清白蛋白與次氯酸溶液以摩爾比例1∶140混勻后，室溫下反應(yīng)30min，加入透析膜中并將透析膜在磷酸鹽緩沖液中透析24小時(shí)去除

2、游離次氯酸，將所得樣品用濾器過(guò)濾去除內(nèi)毒素，經(jīng)鱟實(shí)驗(yàn)法測(cè)定內(nèi)毒素含量低于0.25EU/ml。AOPPs-RSA中AOPPs含量的測(cè)定:以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定酸性條件下340nm吸光度值。最終將制備好的AOPPs稀釋至0.20mg/ml后保存于-20℃冰箱備用。
　　2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的藥物干預(yù)及取材。
　　購(gòu)買5月齡雄性新西蘭大白兔（南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）48只，體重2.0～2.5kg。飼養(yǎng)于適宜的環(huán)境中，給予充足的水與食物

3、，嚴(yán)格晝夜周期。經(jīng)10天適應(yīng)環(huán)境后將48只雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分假手術(shù)組（Sham-operated）、對(duì)照組(ACLT+MMx/PBS)和干預(yù)組(ACLT+MMx/AOPPs)，每組16只。采用膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶離斷與內(nèi)側(cè)半月板部分切除術(shù)(ACLT+MMx)建立骨關(guān)節(jié)炎模型。假手術(shù)組:采用與造模手術(shù)相同的手術(shù)入路打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，顯露前交叉韌帶后縫合切口。對(duì)照組與干預(yù)組均采用ACLT+MMx造成骨關(guān)節(jié)炎模型。給予2周時(shí)間愈合手術(shù)傷口后，干預(yù)組

4、行1ml AOPPs(200μg/ml)隔日關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，對(duì)照組給予同等劑量磷酸鹽緩沖液關(guān)節(jié)腔內(nèi)隔日注射，假手術(shù)組不做任何處理。在關(guān)節(jié)腔注射開(kāi)始4w、8w后隨機(jī)取每組中的8只經(jīng)麻醉后以耳緣靜脈注射空氣處死，分離雙側(cè)股骨及脛骨標(biāo)本。關(guān)節(jié)標(biāo)本的股骨與脛骨分離后剝除表面軟組織，生理鹽水紗布包埋后儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。
　　3.檢測(cè)指標(biāo):
　　(1)對(duì)膝關(guān)節(jié)標(biāo)本行肉眼大體觀察，取股骨髁作為組織標(biāo)本，行India ink大體標(biāo)本染色

5、，并以India ink染色大體評(píng)分法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　(2)股骨髁切片行番紅O固綠染色。以Mankin評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨的損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　(3)取關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織為標(biāo)本，提取滑膜組織中蛋白并通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western-blot)檢測(cè)滑膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs) MMP-3與MMP-13的表達(dá)量。
　　研究結(jié)果：

6、>　　1.AOPPs組4周和8周India ink染色大體觀察評(píng)分分別為(4.19±0.60)、(5.75±0.60)，假手術(shù)組分別為(1.06±0.18)、(1.38±0.60)，磷酸鹽緩沖液組分別為(2.50±0.46)、(3.06±0.62)，磷酸鹽緩沖液組的India ink大體評(píng)分在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均較假手術(shù)組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。AOPPs組的India ink染色大體評(píng)分在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較另外兩組高，且差異均具

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.組織學(xué)觀察AOPPs組4周和8周Mankin評(píng)分分別為(8.19±0.70)、(11.94±0.90)，假手術(shù)組分別為(0.75±0.53)、(1.06±0.73)，磷酸鹽緩沖液組分別為(4.25±1.46)、(4.50±0.89)，磷酸鹽緩沖液組的Mankin評(píng)分在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。AOPPs組的Mankin評(píng)分在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均高于另外兩組，且

8、差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.AOPPs組4周和8周滑膜組織中MMP-3、MMP-13相對(duì)表達(dá)量分別為(1.006±0.080)、(1.098±0.088)，假手術(shù)組分別為(0.066±0.006)、(0.053±0.011)，磷酸鹽緩沖液組分別為(0.552±0.024)、(0.839±0.084)。磷酸鹽緩沖液組滑膜組織中MMP-3、MMP-13的表達(dá)量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較假手術(shù)組高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0