生長分化因子-5及堿性成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)家兔椎間盤髓核細(xì)胞成骨的研究.pdf

1、背景：腰椎滑脫是骨科的常見病癥之一，以反復(fù)腰痛為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。而腰椎滑脫患者最終大多數(shù)需要手術(shù)矯正，術(shù)中用于脊柱融合的材料存在各種不足，如果能通過人工干預(yù)使椎間盤骨化，則有望達(dá)到脊柱融合的目的。有研究顯示，GDF-5在軟骨發(fā)生和長骨發(fā)育中具有重要的作用，能誘導(dǎo)多種細(xì)胞向成軟骨和成骨細(xì)胞分化，這表明其可誘導(dǎo)類軟骨細(xì)胞-髓核細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。
　　目的：本實驗通過建立家兔椎間盤髓核細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型，觀察髓核

2、細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特性和生物學(xué)特性，然后在給予 rhGDF-5和 bFGF進(jìn)行人工干預(yù)后，探討rhGDF-5和bFGF對髓核細(xì)胞表型表達(dá)和分化特性的影響，并為直接誘導(dǎo)椎間盤髓核細(xì)胞成骨行椎間融合提供理論依據(jù)。
　　方法：1.從健康家兔取出椎間盤髓核，用Ⅱ型膠原酶消化法分離原代椎間盤髓核細(xì)胞后，單層培養(yǎng)并以胰酶消化法傳代，采用差速貼壁法進(jìn)行純化。2.觀察髓核細(xì)胞在細(xì)胞因子rhGDF-5和bFGF誘導(dǎo)下成骨表型表達(dá)和細(xì)胞學(xué)特性的變化。按試驗

3、中的細(xì)胞培養(yǎng)條件分為四個培養(yǎng)組：A組：DMEM/15％FBS培養(yǎng)液；B組：DMEM/15%FBS培養(yǎng)液+rhGDF-5；C組：DMEM/15%FBS培養(yǎng)液+bFGF；D組：DMEM/15%FBS培養(yǎng)液+rhGDF-5+bFGF。3.利用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法測定生長曲線，免疫組化觀察Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的表達(dá)，放射免疫技術(shù)測定骨鈣素的表達(dá)，茜素紅染色等。
　　結(jié)果：初貼壁的髓核細(xì)胞呈短梭形、多角形，融合后呈旋渦狀，傳代后呈

4、長梭形或星形，培養(yǎng)后期呈明顯的趨化性生長、極性排列。大約于第五代時細(xì)胞出現(xiàn)生長滯緩，即出現(xiàn)老化現(xiàn)象。rhGDF-5能夠抑制細(xì)胞的增殖；增加骨鈣素的表達(dá)；促進(jìn)鈣鹽的沉積，形成鈣結(jié)節(jié)。bFGF能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖；對骨鈣素表達(dá)無明顯影響；促進(jìn)Ⅰ型膠原的表達(dá)；促進(jìn)鈣鹽沉積，形成鈣結(jié)節(jié)。當(dāng)聯(lián)合使用 rhGDF-5和bFGF時，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖；能夠促進(jìn)Ⅰ型膠原、骨鈣素的表達(dá)和鈣鹽的沉積，其效果要比單獨使用任一細(xì)胞因子都好。四個組的Ⅱ型膠原表達(dá)均為