乙型肝炎病毒包膜蛋白前S1區(qū)結(jié)合蛋白的分離鑒定.pdf

1、目的: 通過(guò)對(duì)HepG2細(xì)胞膜上乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）前S1區(qū)（preS1）結(jié)合蛋白的分離并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，以及對(duì)preS1與鑒定出的蛋白在細(xì)胞膜水平上和體外的相互作用進(jìn)行研究，從而鑒定preS1在HepG2細(xì)胞膜上的結(jié)合蛋白，為繼續(xù)深入探索乙型肝炎病毒的肝細(xì)胞膜受體進(jìn)而揭示HBV的入侵機(jī)制打下基礎(chǔ)。 策略與方法: 1.HepG2細(xì)胞膜上preS1結(jié)合蛋白的分離：利用基因重組技術(shù)

2、將HBV preS1基因與GST標(biāo)簽在原核表達(dá)系統(tǒng)中融合表達(dá)；以融合蛋白GST-preS1為探針蛋白，與生物素標(biāo)記膜蛋白的HepG2全細(xì)胞裂解液孵育，利用pull down技術(shù)分離HepG2細(xì)胞膜上與preS1結(jié)合的蛋白。 2.對(duì)分離出的preS1結(jié)合蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定：利用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用離子阱質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，儀器根據(jù)質(zhì)潛分析獲得的肽序列譜圖自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，采用Spectrum Mill proteomics soft

3、ware在SwissPort數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索針對(duì)人的序列，通過(guò)預(yù)設(shè)條件的篩選從而鑒定出相應(yīng)蛋白。 3.對(duì)鑒定出的蛋白進(jìn)行原核表達(dá)：從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得目的蛋白的基因序列，利用基因重組技術(shù)將基因與His標(biāo)簽在原核表達(dá)系統(tǒng)中融合表達(dá)。 4.用激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）觀察鑒定出的蛋白在HepG2細(xì)胞中的分布情況，采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence

4、resonance energy transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜水平上preS1與鑒定蛋白的相互作用。 5.通過(guò)體外結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證preS1與鑒定蛋白之間的相互作用。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pGST-preS1，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。采用親和層析法對(duì)表達(dá)的GST-prerS1融合蛋白進(jìn)行純化，純度在90％以上，GST-preS1可以與抗preS1（37-45aa）位點(diǎn)的特異性

5、單抗結(jié)合，顯示出良好的抗原性。 2.以融合蛋白GST-preS1為探針蛋白，利用pull down技術(shù)，從HepG2細(xì)胞膜上分離到一分子量約為110kDa大小的蛋白條帶（p110）。 3.切取p110蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過(guò)相應(yīng)篩選鑒定出了兩個(gè)蛋白：78 kDa glucose-regulated protein precursor（GRP78）與LanC-like protein1（LANCL1）。 4.成功

6、構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pW28-GRP78與pW28-LANCL1，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，采用親和層析法對(duì)表達(dá)的His-GRP78與His-LANCL1融合蛋白進(jìn)行純化，純度在95％以上，融合蛋白可以與各自的特異性抗體結(jié)合，顯示出良好的抗原性。 5.在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，可見(jiàn)GRP78均勻分布在HepG2細(xì)胞膜上，證實(shí)GRP78為膜蛋白成份。 6.preS1與培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞孵育后，激光掃描共聚焦顯微鏡