埃博拉病毒包膜蛋白GP細(xì)胞毒性機(jī)理研究.pdf

1、第一部分埃博拉病毒包膜蛋白GP細(xì)胞毒性機(jī)理探討
　　 埃博拉病毒(Ebola virus)屬于絲狀病毒科(Filoviridae),為單股負(fù)鏈RNA包膜病毒,分4個(gè)亞型,即埃博拉-扎伊爾型(EBO-Zaire)、埃博拉-蘇丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-萊斯頓型(EBO-Reston)和埃博拉-科特迪瓦型(EBO-Ivory Coast)。埃博拉病毒能夠引起人嚴(yán)重出血熱(Ebola hemorrhagic fever,EHF

2、),被列為生物安全第四級(jí)(Biosafety Level4)病毒,其中EBO-Zaire致死率高達(dá)90％。埃博拉病毒包膜蛋白GP(Glycoprotein)是唯一的表面包膜蛋白,在介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用,同時(shí)GP被認(rèn)為是決定埃博拉致病性一個(gè)重要因素。研究表明,體外通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)GP基因的質(zhì)?；蛳俨《巨D(zhuǎn)染GP基因進(jìn)入宿主細(xì)胞,能夠?qū)е滤拗骷?xì)胞的脫落,表明埃博拉病毒包膜蛋白GP具有細(xì)胞毒性,但是其機(jī)理不詳(1)。彌漫性血管內(nèi)凝血(

3、Disseminated Intravascular Coagulation,DIC)是埃博拉出血熱的主要特征之一,血管內(nèi)皮細(xì)胞被認(rèn)為埃博拉病毒的致病機(jī)理中發(fā)揮著重要作用,有報(bào)道表明埃博拉病毒包膜蛋白是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能異常重要因素(1)。本研究論文通過(guò)體外表達(dá)和純化EBO-Zaire包膜蛋白GP亞單位GPl-Fc融合蛋白,將純化的包膜蛋白加入到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),首次發(fā)現(xiàn)純化的包膜蛋白GPl能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞的脫

4、落。實(shí)驗(yàn)表明在蛋白終濃度為800 nmol-1時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞脫落現(xiàn)象比較明顯,并且在蛋白處理后24 h小時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)脫落現(xiàn)象。因此,本研究首次在體外建立了GPl蛋白引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞脫落的細(xì)胞毒性模型,并且發(fā)現(xiàn)GPl蛋白能夠引起HUVECs的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)上調(diào),但具體機(jī)理仍然不清楚。并且已提取HUVECs細(xì)胞mRNA,擬通過(guò)二代測(cè)序的方法探討GPl蛋白引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞脫落的機(jī)理。
　　 第二部

5、分埃博拉假病毒包裝及GP多克隆抗體制備與效果評(píng)價(jià)
　　 鑒于埃博拉病毒的高致病性和傳染性,埃博拉假病毒能夠代替活病毒的部分研究,本實(shí)驗(yàn)探討通過(guò)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)和二質(zhì)粒共轉(zhuǎn)的方法包裝埃博拉假病毒的可行性。通過(guò)共轉(zhuǎn)染pQCXIX(含GFP報(bào)告基因),gag/pol質(zhì)粒和pEAK13GP三個(gè)質(zhì)粒包裝表達(dá)GFP報(bào)告基因的埃博拉假病毒；通過(guò)共轉(zhuǎn)染pNL4-3.Luc.R-E-和pEAK13GP兩個(gè)質(zhì)粒包裝表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的埃博拉假病毒。實(shí)驗(yàn)

6、表明三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)包裝的埃博拉假病毒滴度較低,二質(zhì)粒共轉(zhuǎn)包裝假病毒感染293T細(xì)胞后熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)較高。
　　 研制包膜蛋白GP抗體,對(duì)于埃博拉病毒的致病機(jī)理以及藥物研發(fā)方面均有非常重要的作用,但是市場(chǎng)上至今沒(méi)有相應(yīng)的埃博拉病毒GP單克隆抗體銷售,本實(shí)驗(yàn)探討埃扎伊爾-埃博拉病毒(Zaire Ebola virus)包膜蛋白(GP)DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體的特性及研制埃博拉病毒DNA疫苗的可行性。通過(guò)構(gòu)建埃博拉病毒包膜蛋

7、白GP真核表達(dá)質(zhì)粒pEAK13CD5LGP,采用100μg劑量的質(zhì)粒免疫小鼠,以純化的埃博拉病毒包膜蛋白亞單位融合蛋白(GPl-Fc)作為抗原,通過(guò)ELISA檢測(cè)及Western blot驗(yàn)證測(cè)定血清抗體滴度及特異性。實(shí)驗(yàn)表明100μg質(zhì)粒免疫小鼠三次后,小鼠血清中GP中和抗體滴度達(dá)到1:2000。含埃博拉病毒包膜蛋白GP基因的DNA疫苗(pEAK13CD5LGP)能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度和持久的中和抗體,作為埃博拉病毒疫苗具有潛在的應(yīng)用