登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1和包膜蛋白Ⅲ區(qū)B細(xì)胞表位研究.pdf

1、由登革病毒(dengue virus， DENV)所致的登革熱是熱帶和亞熱帶地區(qū)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，在我國(guó)南方地區(qū)，特別是東南沿海各省幾乎每年均有登革熱流行。DENV有4種血清型依次為DENV-1、-2、-3和-4。任何一種血清型的感染均可引起一系列的臨床癥狀，包括隱匿性感染、典型登革熱(DF)以及危脅生命的登革出血熱(DHF)或登革休克綜合征(DSS)。初次感染DENV后，對(duì)于同型病毒的再次感染可產(chǎn)生長(zhǎng)久的免疫力，但Ⅰ～Ⅳ型DENV之

2、間缺乏交叉免疫保護(hù)作用，因而生活在疫區(qū)的每個(gè)人一生中都有可能面臨Ⅰ～Ⅳ型DENV感染的威脅。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示再次感染異型DENV是導(dǎo)致DENV感染患者發(fā)生DHF/DSS的重要危險(xiǎn)因素，由于在一個(gè)地區(qū)存在不同血清型DENV的交替流行，人群普遍易感，這就更增加了DHF/DSS發(fā)生的可能性，也是目前研制特異性登革疫苗的主要障礙。
　　 當(dāng)前人類對(duì)登革熱的防治面臨著許多難題，沒(méi)有特異性的治療藥物和安全有效的疫苗，但及時(shí)采取臨床救治措

3、施可以大大減少DHF/DSS的發(fā)病率和死亡率，由于多數(shù)DENV感染者早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)，僅有發(fā)熱、寒戰(zhàn)等流感樣癥狀，難以跟其它發(fā)熱疾病和出血熱疾病區(qū)分，必須依賴實(shí)驗(yàn)室的診斷加以確認(rèn)。然而，當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室診斷存在眾多問(wèn)題：病毒分離培養(yǎng)和RT-PCR等檢測(cè)技術(shù)影響因素多，需要昂貴儀器、專門(mén)的操作場(chǎng)地及熟練技術(shù)人員，不利于推廣；黃病毒屬病毒間抗體具有廣泛的交叉反應(yīng)性，血清學(xué)檢測(cè)抗體的方法難以區(qū)分是黃病毒屬疫苗接種的結(jié)果還是DENV感染結(jié)果。因

4、此，研制疫苗和早期診斷免疫試劑是目前登革熱防治的迫切任務(wù)。針對(duì)當(dāng)前DENV感染防治中存在的問(wèn)題，本課題旨在鑒定DENV蛋白中可作為診斷靶標(biāo)和疫苗候選蛋白的B細(xì)胞表位，為研制DENV感染診斷試劑和疫苗的奠定基礎(chǔ)。
　　 DENV非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性的體液免疫和細(xì)胞免疫，是DENV疫苗研制的靶標(biāo)。NS1上既有血清型特異性表位，同時(shí)也存在Ⅰ～Ⅳ型DENV交叉反應(yīng)性表位，是一種理想的早期分型診斷標(biāo)

5、志物。DENV包膜(E)蛋白中第三功能區(qū)(EⅢ)是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立和完整的區(qū)域，暴露于病毒顆粒表面，是E蛋白中誘導(dǎo)中和抗體的主要區(qū)域，針對(duì)EIII的特異性抗體是拮抗病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合的最強(qiáng)拮抗劑，因此，EⅢ是DENV特異性亞單位疫苗的主要候選。了解病毒蛋白表位及其如何誘導(dǎo)保護(hù)性和致病性免疫應(yīng)答將有助于研制有效疫苗和診斷試劑。本研究首先采用Ⅰ～Ⅳ型重組DENVNS1蛋白和對(duì)應(yīng)的同型DENV分別免疫小鼠制備針對(duì)Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1的交叉性單抗

6、、每種血清型特異性單抗和動(dòng)物免疫血清，這些小鼠單抗和免疫血清同覆蓋DENV-1NS1蛋白的重疊多肽反應(yīng)，鑒定DENV-1NS1上的B細(xì)胞表位和優(yōu)勢(shì)表位：接著采用畢赤酵母表達(dá)的重組DENV-1EIII免疫小鼠，制備針對(duì)Ⅰ～Ⅳ型DENVEIII的交叉性中和單抗和DENV-1血清型特異性中和單抗，采用針對(duì)DENV-1EⅢ中和單抗同覆蓋DENV-1EⅢ蛋白的重疊多肽反應(yīng)鑒定DENV-1E蛋白EⅢ上中和B細(xì)胞表位。以上研究為研制DENV感染的診斷

7、試劑和疫苗提供依據(jù)。
　　 本研究的目的在于：(1)全面分析DENV-1NS1蛋白的B細(xì)胞表位：(2)精確定位DENV-1E蛋白EIII中和B細(xì)胞表位。這些DENV蛋白上的B細(xì)胞表位為研制DENV診斷試劑和疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究分為3個(gè)部分：
　　 第一部分：DENV NS1單抗、DENV-1 EIII單抗以及免疫動(dòng)物血清的制備與鑒定
　　 首先采用Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1重組蛋白及其對(duì)應(yīng)同型DENV

8、分別免疫Balb/c小鼠，制備鑒定針對(duì)Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1的交叉反應(yīng)單抗、每種血清型特異性單抗和對(duì)應(yīng)的動(dòng)物血清。從9只DENV-1NS1免疫小鼠，4只DENV-2NS1免疫小鼠，4只DENV-3NS1免疫小鼠，10只DENV-4NS1免疫小鼠中共獲得抗DENVNS1單抗149株和對(duì)應(yīng)的27只NS1小鼠免疫血清，這些單抗Ig亞類大多數(shù)為IgG1，其中25株DENV-1NS1血清型特異性單抗，20株DENV-2NS1血清型特異性單抗，15

9、株DENV-3NS1血清型特異性單抗和15株DENV-4NS1血清型特異性單抗，其它74株交叉反應(yīng)性單抗以不同的方式同Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1反應(yīng)。
　　 接著采用DENV-1EIII重組蛋白為免疫原，免疫Balb/c小鼠，制備抗DENV-1EIII單抗，鑒定單抗的免疫學(xué)特性、中和活性和交叉反應(yīng)性。共制備抗DENV-1EIII單抗37株，36株單抗具有中和活性，這些單抗亞類大多數(shù)為IgG1。這些中和單抗中，其中17株DENV-1血

10、清型特異性單抗，9株Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉反應(yīng)性單抗，其它10株交叉反應(yīng)性單抗以不同的方式同Ⅰ～Ⅳ型DENVEⅢ反應(yīng)。
　　 這些單抗和動(dòng)物免疫血清為下一步研究蛋白的B細(xì)胞表位奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：DENV-1 NS1 B細(xì)胞表位的鑒定
　　 149株來(lái)源于Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1的針對(duì)Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1的交叉單抗、每種血清型特異性單抗和對(duì)應(yīng)的27只小鼠免疫血清與一組覆蓋DENV-1NS1蛋白的重疊1

11、5肽反應(yīng)，分析DENV-1NS1的B細(xì)胞表位。在25株DENV-1血清型特異性單抗中大多數(shù)單抗同DENV-1NS1的3個(gè)區(qū)域反應(yīng)，對(duì)應(yīng)DENV-1NS1氨基酸殘基序列依次位于第1-15、71-85和338-352。蛋白序列比對(duì)分析表明以上3個(gè)DENV-1血清型特異性抗體識(shí)別表位在黃病毒屬病毒或Ⅰ～Ⅳ型DENV無(wú)共同序列，在目前已報(bào)道的DENV-1分離株中高度保守，提示這3個(gè)區(qū)域是DENV-1血清型特異性B細(xì)胞表位。Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交

12、叉單抗鑒定DENV-1NS1上5個(gè)Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉B細(xì)胞表位，位于DENV-1NS1氨基酸殘基第21-35、111-125、191-205、261-275和291-305。蛋白序列比對(duì)分析表明以上Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉B細(xì)胞表位中的25VHTWTEQYKFQ35、112KYSWKSWGKAK122、193AVHADMGYWIES204、266GPWHLGKLE274和294RGPSLRTTT302在已報(bào)道的Ⅰ～Ⅳ型DENV分離

13、株中高度保守，提示這5個(gè)表位是Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉B細(xì)胞表位。DENV-1NS1免疫小鼠血清反應(yīng)結(jié)果表明位于DENV-1NS1氨基酸殘基第1-15和21-35的2區(qū)域具有高度的免疫反應(yīng)性，提示以上2區(qū)域是DENV-1NS1上優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位，DENV-1NS1第1-15是優(yōu)勢(shì)DENV-1血清型特異性免疫B細(xì)胞表位。DENVNS1上氨基酸殘基第111-125、191-205和261-275在每種血清型DENVNS1免疫動(dòng)物血清中均表現(xiàn)出

14、強(qiáng)的免疫原性，提示以上3個(gè)區(qū)域是DENVNS1上優(yōu)勢(shì)Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉B細(xì)胞表位。這些NS1上免疫優(yōu)勢(shì)的DENV-1血清型特異性B細(xì)胞表位和Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉B細(xì)胞表位可能有助于研制DENV疫苗和診斷試劑。
　　 第三部分：DENV-1EⅡI中和B細(xì)胞表位鑒定
　　 36株針對(duì)DENV-1EIII中和單抗同兩組分別覆蓋DENV-1EⅢ的重疊反應(yīng)多肽(12肽和16肽)反應(yīng)定位DENV-1EⅢ上的誘導(dǎo)中和抗體的B

15、細(xì)胞表位。17株DENV-1血清型特異性中和單抗中2株分別同DENV-1EⅢ的2個(gè)區(qū)域反應(yīng)，位于DENV-1E蛋白氨基酸殘基序列第329-348和381-392。蛋白序列比對(duì)分析表明以上兩區(qū)域黃病毒屬病毒或Ⅰ～Ⅳ型DENV無(wú)共同序列，僅DENV-1E蛋白氨基酸殘基第381-392在目前已報(bào)道的DENV-1分離株中高度保守，提示DENV-1E蛋白氨基酸殘基第333-348是DENV-1分離株特異性中和B細(xì)胞表位，第381-392是DENV

16、-1血清型特異性中和B細(xì)胞表位。9株Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和單抗中7株同DENV-1EⅢ的1個(gè)區(qū)域反應(yīng)，位于DENV-1E蛋白氨基酸殘基序列第309-320，蛋白序列比對(duì)分析表明DENV-1E蛋白中310KEVAETQHGT319在已報(bào)道的Ⅰ～Ⅳ型DENV分離株中高度保守，氨基酸殘基替代發(fā)現(xiàn)DENV-1中E309、V312、A313和V320不影響蛋白抗原性，提示該位點(diǎn)是Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B細(xì)胞表位。這些DENV-1 E蛋

17、白EIII上中和B細(xì)胞表位可能有助于研制新的DENV亞單位疫苗。
　　 小結(jié)：
　　 綜合以上三個(gè)部分的研究結(jié)果，本研究的發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新點(diǎn)如下：
　　 一、采用一組來(lái)源于Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1的每種血清型特異性單抗、交叉單抗和免疫血清全面分析DENV-1NS1的B細(xì)胞表位。精確定位3個(gè)DENV-1NS1血清型特異性B細(xì)胞表位分別位于NS1蛋白氨基酸殘基第1-15、71-85和338-352位氨基酸。蛋白序列比對(duì)分析表

18、明這3個(gè)DENV-1血清型特異性B細(xì)胞表位在已報(bào)道的DENV-1分離株中高度保守，其中aa1-15在DENV-1NS1免疫小鼠血清中有很強(qiáng)的抗原性，是免疫優(yōu)勢(shì)DENV-1NS1血清型特異性B細(xì)胞表位。精確定位Ⅰ～Ⅳ型DENVNS1共同交叉表位的依次位于NS1蛋白氨基酸殘基第21-35、111-125、191-205、261-275和291-305位氨基酸。以上5個(gè)Ⅰ～Ⅳ型DENV NS1共同交叉表位中25VHTWTEQYKFQ35、11

19、2KYSWKSWGKAK122、193AVHADMGYWIES204、266GPWHLGKLE274和294RGPSLRTTT302在已報(bào)道的Ⅰ～Ⅳ型DENV分離株中高度保守，其中區(qū)域111-125aa、191-205aa和261-275aa在各型DENV-NS1免疫血清中有強(qiáng)的抗原反應(yīng)性，區(qū)域aa21-35在DENV-1NS1免疫小鼠血清和DENV-2NS1免疫小鼠血清中具有很強(qiáng)的抗原反應(yīng)性。這些新發(fā)現(xiàn)的NS1血清型特異性和Ⅰ～Ⅳ型共

20、同交叉的B細(xì)胞表位將有助于DENV疫苗和分型診斷試劑盒的研制。
　　 二、采用一組來(lái)源于DENV-1E蛋白EⅢ的中和單抗分析DENV-1E蛋白EⅢ誘導(dǎo)中和抗體的B細(xì)胞表位。精確定位1個(gè)DENV-1血清型特異性中和B細(xì)胞表位，位于DENV-1E蛋白氨基酸殘基第381-392位氨基酸，蛋白序列比對(duì)分析表明該表位在已報(bào)道的DENV-1分離株中高度保守。精確定位1個(gè)Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B細(xì)胞表位，位于DENV-1E蛋白氨基酸殘基