缺血預(yù)處理減輕大鼠小腸移植急性排斥反應(yīng)及菌群易位作用的研究.pdf

1、目的:以往的多項(xiàng)研究證明，缺血預(yù)處理（Ischemic preconditioning IPC）對(duì)大鼠小腸移植后供體小腸所受缺血再灌注損傷（Ischemic reperfusion I/R）存在顯著的保護(hù)作用。而炎癥反應(yīng)和移植手術(shù)帶來(lái)的I/R損傷可能是加重急性排斥反應(yīng)（Acute cell rejection AR）及菌群易位（Bacterial Translocation BT）的重要原因之一。那么，IPC對(duì)大鼠小腸移植后發(fā)生的急性排

2、斥反應(yīng)及菌群易位是否也存在保護(hù)作用？本實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹紮z驗(yàn)這個(gè)推論。
　　 方法：
　　 1.動(dòng)物模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組Andrea Ferencz等在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)：2min缺血后繼以2min再灌注的IPC方案足以觸發(fā)保護(hù)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)參照此方案，以Wistar大鼠為供體（188.4±23.6g），Brown-Norway大鼠為受體（198.0±29.2g）建立原位異基因小腸移植模型。實(shí)驗(yàn)選取術(shù)后第4天、第7天兩個(gè)觀察點(diǎn)，分別觀察小

3、腸移植后排斥反應(yīng)的初期和進(jìn)展期。隨機(jī)選取體重相當(dāng)?shù)拇笫笈鋵?duì)并分為4組，IPC4d和Ctrl4d、IPC7d和Ctrl7d。在IPC4d組中（n=7），取下供體小腸之前先進(jìn)行缺血預(yù)處理：以無(wú)創(chuàng)顯微血管鉗鉗閉供體小腸腸系膜上動(dòng)脈（Superior mesentery artery SMA），使供體小腸經(jīng)歷2分鐘缺血，緊接著松開(kāi)血管鉗，進(jìn)行2分鐘再灌注。IPC結(jié)束后立即夾閉SMA上方的腹主動(dòng)脈阻斷動(dòng)脈血流，剪斷門(mén)靜脈，以4℃肝素凌格氏液經(jīng)動(dòng)脈

4、灌洗小腸血管系統(tǒng)使供腸降溫。移植完成之后第4日處死受體采集標(biāo)本。在IPC7d （n=7）組中，同樣采用上述2min-2min IPC方案，受體在第7天被處死。同時(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)立兩組對(duì)照組：Ctrl4d（n=7）、Ctrl7d（n=7），進(jìn)行同樣的移植手術(shù)，但不進(jìn)行IPC，分別在第4、第7日處死受體采集標(biāo)本。
　　 2.手術(shù)方式與標(biāo)本采集供體手術(shù)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在異氟烷持續(xù)吸入麻醉下接受相對(duì)無(wú)菌移植手術(shù)。取供體大鼠屈氏韌帶下5至6cm至回盲瓣

5、以上3至4cm之間的全部空回腸，約占全小腸的80％。手術(shù)將供體小腸充分游離，僅由帶有主動(dòng)脈袖的腸系膜上動(dòng)脈和門(mén)靜脈與供體大鼠相連，此時(shí)術(shù)者隨機(jī)決定是否進(jìn)行IPC。IPC結(jié)束后立即夾閉SMA上方的腹主動(dòng)脈阻斷動(dòng)脈血流，剪斷門(mén)靜脈，以4℃肝素凌格氏液（含低分子量肝素10 units/ml）經(jīng)動(dòng)脈灌洗小腸血管系統(tǒng)使供腸降溫，直至供腸顏色雪白，緊接著用濕紗布包裹供體小腸貯藏在4℃冷凌格液中。與此同時(shí)進(jìn)行受體手術(shù)。
　　 受體手術(shù)：先以連

6、續(xù)端-側(cè)吻合門(mén)靜脈-下腔靜脈，緊接著以連續(xù)褥式端-側(cè)吻合主動(dòng)脈袖-腹主動(dòng)脈。供體血液循環(huán)重新建立后，將供腸納入腹腔，與此同時(shí)切除受體大鼠80％自體小腸腸管，保留20％自體小腸以便觀察對(duì)照。消化道連續(xù)性由兩個(gè)供體受體腸管之間的端-端吻合達(dá)成。受體術(shù)后放置于電熱毯上直到從麻醉中完全蘇醒。禁水2小時(shí)，禁食24小時(shí)后恢復(fù)正常喂養(yǎng)。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別于手術(shù)后第4日、第7日在深麻醉下處死受體大鼠，無(wú)菌條件下采集腔靜脈血液標(biāo)本7ml左右，4ml全血標(biāo)本

7、分別注入需氧菌、厭氧菌細(xì)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，其余全血在4℃下以3000rd/min離心5分鐘，以采集血漿標(biāo)本用于免疫化學(xué)分析。采集近端吻合口前方受體自身回腸，以及吻合口后方供體回腸腸管，全部肺臟，肝臟，各取適當(dāng)大小組織塊置于5ml無(wú)菌離心管內(nèi)，液氮急凍以備免疫化學(xué)分析。其余組織置于10％福爾馬林中固定，做組織學(xué)檢測(cè)。
　　 3.組織學(xué)
　　 分別記錄肺、肝的全重。肝臟、肺臟和小腸的固定標(biāo)本經(jīng)脫水、包埋后，切片5μm，蘇木

8、精-伊紅常規(guī)染色，檢查病理?yè)p傷。依照臨床小腸移植建立的評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行小腸急性細(xì)胞排斥反應(yīng)評(píng)分。在供體小腸和自體小腸切片低倍鏡視野中隨機(jī)選擇30個(gè)點(diǎn)測(cè)量絨毛高度和陷窩深度，在5個(gè)隨機(jī)高倍視野中計(jì)數(shù)細(xì)胞分裂相，以上均由兩位作者用盲法重復(fù)測(cè)量。
　　 4．免疫化學(xué)
　　 IL-1β與TNFα是經(jīng)典的參與炎癥、免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子，他們?cè)诮M織及循環(huán)中的濃度與免疫活動(dòng)相關(guān)；MPO是中性粒細(xì)胞顆粒的主要成分，他在組織中的濃度代表著中性粒

9、細(xì)胞密度。本實(shí)驗(yàn)以雙抗體夾心法進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme Linked Immune Sorbent Assay ELISA）測(cè)定血漿和組織勻漿中TNFα（eBioscience 88-7340）和IL-1β（eBioscience 88-6010）的水平以及組織勻漿中MPO（Hycult Biotechnology B.V.HK105）活性，試圖從免疫化學(xué)的角度估計(jì)急性排斥反應(yīng)嚴(yán)重程度。所有實(shí)驗(yàn)操作都嚴(yán)格依照試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)

10、進(jìn)行。
　　 5．微生物學(xué)大鼠移植術(shù)后菌血癥的持續(xù)狀態(tài)意味著菌群易位的發(fā)生。采集循環(huán)血樣分別注入?yún)捬蹙托柩蹙囵B(yǎng)瓶?jī)?nèi)（BacT/ALERT? 3D Microbial Detection System Ref:259791，259793 Biomerieux Inc.），置于自動(dòng)孵育器內(nèi)孵育5日，如果每毫升血樣有大于等于100個(gè)菌落生長(zhǎng)，則視為培養(yǎng)陽(yáng)性，既無(wú)陽(yáng)性菌又無(wú)陰性菌生長(zhǎng)的視為培養(yǎng)陰性。
　　 結(jié)果：
　

11、　 1.移植手術(shù)成功率實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后3日內(nèi)死亡則被視為手術(shù)失敗，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)囊浦灿?xùn)練，成功率達(dá)到84.6％ （78例中66例成功）。
　　 2.組織學(xué)
　　 各組的器官重量沒(méi)有顯著區(qū)別。在顯微鏡下觀察肝、肺的HE切片，未見(jiàn)任何有意義的病理改變，各組差別不明顯。
　　 小腸急性排斥反應(yīng)評(píng)分：第4日的IPC組和相應(yīng)的對(duì)照組間AR評(píng)分沒(méi)有顯著差異，第7日的IPC組比對(duì)照組獲得較高的評(píng)分，但是差異不顯著。各組供體小腸與自體

12、小腸絨毛高度和陷窩深度無(wú)顯著性差異。粘膜細(xì)胞分裂相計(jì)數(shù)各組之間差異不顯著。
　　 3.細(xì)胞因子免疫化學(xué)TNFα：手術(shù)后第4日，IPC4d組接受預(yù)處理以后，自體小腸組織內(nèi)的TNFα水平與對(duì)照組相比顯著增高（P＜0.05）。手術(shù)后第7日，IPC7d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，自體小腸內(nèi)的TNFα水平都顯著增高（P＜0.05），而供體小腸內(nèi)的TNFα水平在各組之間都沒(méi)有顯著性差異。在第4日與第7日，IPC4d組與IPC7d組TNFα血清濃度都

13、較其它組顯著的提高了（P＜0.05）。
　　 IL-1β：手術(shù)后第4日的IL-1β水平在供體自體小腸組織內(nèi)都沒(méi)有顯著區(qū)別，但是第7日，2min預(yù)處理使供體小腸內(nèi)的IL-1β顯著升高（P＜0.05）。第4日，各組血漿IL-1β水平?jīng)]有顯著區(qū)別，第7日，2min預(yù)處理明顯的降低了血漿IL-1β水平（P＜0.05）。
　　 4.髓過(guò)氧化物酶（Myeloperoxidase MPO）分析中性粒細(xì)胞是急性排斥反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞之一，髓

14、過(guò)氧化物酶（Myeloperoxidase MPO）主要存在于中性粒細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA分析MPO水平來(lái)推斷小腸急性排斥反應(yīng)過(guò)程中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)組織的情況。移植后的第4日，各組供體小腸和自體小腸中MPO的水平很相似。而第7日時(shí)，2minIPC的供體小腸中MPO的含量顯著的降低了（P＜0.05）。
　　 5.微生物學(xué)術(shù)后早第4日，IPC4d組與對(duì)照組相比，系統(tǒng)血標(biāo)本細(xì)菌的培養(yǎng)陽(yáng)性率，尤其是格蘭氏陰性菌的培養(yǎng)陽(yáng)性率，顯著的降低

15、了（P＜0.05），這顯示出2min IPC在早期對(duì)菌群易位具有一定的防止作用。而急性排斥反應(yīng)顯著的時(shí)候（第7日），IPC無(wú)法改變細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果。
　　 結(jié)論：
　　 1、IPC明顯降低了術(shù)后第7日供體小腸組織中MPO的含量，這表明IPC能顯著抑制小腸移植后急性排斥反應(yīng)進(jìn)展期供腸內(nèi)的中性粒細(xì)胞聚集。
　　 2、IPC顯著降低了術(shù)后第4日循環(huán)血液標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率，可以推論IPC在急性排斥反應(yīng)早期能有效地減少菌群易