中藥預(yù)防大鼠小腸移植慢性排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:大鼠小腸移植模型的建立和鑒定 目的：建立大鼠小腸移植模型并研究排斥反應(yīng)機(jī)理。 方法：利用顯微外科技術(shù)構(gòu)建同系和異系大鼠小腸移植模型，分為3組：同系移植組、異系移植組、異系移植使用CsA組 (環(huán)孢素組)。分別在術(shù)后7天、14天、28天、60天進(jìn)行移植物活檢，常規(guī)病理學(xué)檢測(cè)，應(yīng)用 Realtime-PCR 技術(shù)檢測(cè)移植物內(nèi)IL-4、INF-γ分子 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平以觀察急性排斥反應(yīng)，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) C1

2、368以觀察單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況，使用 Realtime-PCR 技術(shù)和 Western blot技術(shù)檢測(cè)移植物內(nèi)TGF β1、PDGF mRNA 轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平，并應(yīng)用免疫組化方法對(duì)上述兩種蛋白的表達(dá)進(jìn)行定位，以明確其與排斥反應(yīng)的關(guān)系。 結(jié)果：(1)異系移植組全部受體大鼠均在術(shù)后 11 天內(nèi)死亡。(2)環(huán)孢素組IL-4、INF-γ mRNA分子轉(zhuǎn)錄水平在術(shù)后第7天較同期的同系移植組有顯著升高，第14天、28天、60天標(biāo)

3、本的檢測(cè)結(jié)果較同期的同系移植組無(wú)顯著差異。(3)環(huán)孢素組在術(shù)后第60天的慢性排斥反應(yīng)評(píng)分顯著高于同期的同系移植組。(4)CD68檢測(cè)提示在術(shù)后第60 天環(huán)孢素組較同期的同系移植組顯著升高。(5)環(huán)孢素組的 TGF-B1 及 PDGFmRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平在第60天也較同期的同系移植組顯著升高，免疫組化可見(jiàn) TGF-β1及PDGF在間質(zhì)內(nèi)高表達(dá)，表明環(huán)孢素組術(shù)后第60天開(kāi)始出現(xiàn)慢性排斥反應(yīng)，并同時(shí)伴有TGF-β1及PDGF分子的

4、表達(dá)水平升高。 結(jié)論：(1)移植術(shù)后的早期存在急性排斥反應(yīng)。(2)術(shù)后第60天環(huán)孢素組的單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重。(3)異系大鼠小腸移植經(jīng)環(huán)孢素治療組術(shù)后60天即可出現(xiàn)慢性排斥反應(yīng)表現(xiàn)，并同時(shí)伴有 CD68、TGFβ1、PDGF 因子的顯著高表達(dá)，提示C1368、TGFβ1、PDGF對(duì)于判定慢性排斥反應(yīng)具有指導(dǎo)意義。 第二部分:單味中藥對(duì)慢性排斥反應(yīng)的預(yù)防作用 目的：觀察單味中藥對(duì)于慢性排斥反應(yīng)的預(yù)防作用并篩選有效藥

5、物。 方法：利用顯微外科技術(shù)構(gòu)建異系小腸移植模型，受體大鼠應(yīng)用環(huán)孢素1個(gè)月后按照實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)分組，分別給予雷公滕、粉防己堿、青滕堿，同時(shí)設(shè)立同系對(duì)照組及異系對(duì)照組。術(shù)后7天、14天、28天、60天、90 天行移植物活檢，常規(guī)病理學(xué)檢測(cè)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) CD68 以觀察單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況，使用Realtime-PCR 技術(shù)及 Western blot技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TGF β1、PDGFmRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋

6、白表達(dá)水平，于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)移植物和外周血T細(xì)胞亞群以觀察受體和移植物的免疫功能。 結(jié)果:(1)慢性排斥反應(yīng)病理評(píng)分在第90天各組間比較中出現(xiàn)顯著差異，其中粉防己堿組、青藤堿組和異系對(duì)照組評(píng)分顯著高于同期雷公藤組和同系對(duì)照組。(2)CD68 的檢測(cè)結(jié)果在術(shù)后第90 天組間比較中有顯著差異，粉防己堿組、青藤堿組、異系對(duì)照組中表達(dá)顯著高于雷公藤組和同系對(duì)照組。(3)TGFβ1和PDGF mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在術(shù)后第60天

7、和第90天的組間比較中有顯著差異，粉防己堿組、青藤堿組、異系對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于雷公藤組和同系對(duì)照組，TGFβ1和PDGF蛋白定量及免疫組化結(jié)果與mRLNA轉(zhuǎn)錄水平一致。(4)實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè)表明雷公滕組和粉防己堿組CD4+/CD8+顯著降低，移植物T細(xì)胞亞群檢測(cè)表明異系對(duì)照組CD4+/CD8+顯著低于其他各組。(5)肝腎功能檢測(cè)表明粉防己堿組和青藤堿組AST值顯著升高。 結(jié)論:(1)粉防己堿組、青藤堿組和異

8、系對(duì)照組的組織破壞程度和單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度重于雷公藤組和同系對(duì)照組。(2)術(shù)后第60天和第90天，粉防己堿組、青藤堿組、異系對(duì)照組的 TGFβ1和PDGF因子較同時(shí)點(diǎn)各組處于較高水平。(3)雷公藤和粉防己堿對(duì)于免疫功能有一定的抑制作用。(4)異系對(duì)照組移植物CD8+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增多。(5)粉防己堿和青滕堿對(duì)于肝功能有一定影響。(6)雷公滕組與其它中藥治療組相比可更為有效地減低 TGF β1、PDGF因子的表達(dá)，減輕和延緩慢性排斥反應(yīng)的

9、發(fā)生和發(fā)展。 第三部分:復(fù)方中藥對(duì)慢性排斥反應(yīng)的預(yù)防作用 目的：觀察復(fù)方中藥對(duì)慢性排斥反應(yīng)的預(yù)防作用并進(jìn)行篩選有效復(fù)方中藥。 方法：利用顯微外科技術(shù)構(gòu)建異系小腸移植模型，應(yīng)用環(huán)孢素1個(gè)月后，按照實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)分組，在予以雷公藤的基礎(chǔ)上分別給予黃芪、丹參、黃芪-丹參，同時(shí)設(shè)立同系對(duì)照組及異系對(duì)照組。分別于術(shù)后術(shù)后7天、14天、28天、60、90天行移植物活檢，常規(guī)病理學(xué)檢測(cè)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CD68以觀察單核

10、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況，使用 Realtime-PCR 技術(shù)和 Western blot 技術(shù)及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TGFβ1、PDGF mRNA 轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平，以明確各移植組TGFβ1、PDGF 水平的變化，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)終止時(shí)移植物和外周血T細(xì)胞亞群以觀察受體和移植物的免疫功能。 結(jié)果:(1)慢性排斥反應(yīng)病理評(píng)分在第90天各組間比較中出現(xiàn)顯著差異，其中丹參組、黃芪-丹參組、異系對(duì)照組的病理評(píng)分顯著高于同期黃芪組

11、和同系對(duì)照組。(2)CD68的檢測(cè)結(jié)果顯示術(shù)后第90組間比較中有顯著差異，其中異系對(duì)照組CD68表達(dá)顯著高于同期各實(shí)驗(yàn)組和同系對(duì)照組。(3)TGFβ1和PDGF mRNA 轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示在第60天和第90天組間比較有顯著差異。在第60天組間比較，異系對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于同期各組，第90天組間比較表明異系對(duì)照組、丹參組、黃芪-丹參組的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于同期的黃芪組和同系對(duì)照組。(4)實(shí)驗(yàn)終止時(shí)移植物T細(xì)胞亞群檢測(cè)表明

12、，異系對(duì)照組移植物中CD4+/CD8+顯著減低，外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè)中各組之間無(wú)顯著差異。 結(jié)論:(1)丹參組、黃芪-丹參組、異系對(duì)照組的組織損傷程度要重于黃芪組和同系對(duì)照組。(2)異系對(duì)照組單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重。(3)在第60天和第90天異系對(duì)照組、丹參組、黃芪-丹參組的TGFβ1和PDGF因子處于較高水平。(4)異系對(duì)照組移植物中CD8+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增多。(5)雷公藤-黃芪配伍與其它配伍組相比可更為有效地抑制 TGFβ1、P