馬傳染性貧血病毒基因轉(zhuǎn)移載體的優(yōu)化和改造.pdf

1、馬傳染性貧血病毒(Equine Infectious Anemia Virus，EIAV)是一種非靈長類慢病毒，而且是基因組結(jié)構(gòu)最簡單的慢病毒，可以將前病毒基因組持久地整合到感染細胞的染色體上并在感染細胞和子代細胞中表達病毒基因，可作為將外源基因引入細胞的載體。 孫成群利用我國EIAV的研究成果，在中國EIAV驢白細胞弱毒疫苗株(EIAV-DLA)感染性克隆(pOK8266)的基礎(chǔ)上，采用反向遺傳學技術(shù)，構(gòu)建了包括EIAV載體質(zhì)

2、粒、EIAV-gag/pol/rev包裝質(zhì)粒和VSV-G囊膜表達質(zhì)粒的EIAV三質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)移載體系統(tǒng)。 本研究是孫成群開發(fā)的中國EIAV三質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)移載體系統(tǒng)的繼續(xù)，將對其進行一系列優(yōu)化和改造，主要目的在于進一步提高EIAV基因轉(zhuǎn)移載體的轉(zhuǎn)基因效率，同時為四質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)移載體系統(tǒng)的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 1．利用土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)對EIAV基因轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒進行修飾，構(gòu)建了WPRE正向插入p

3、cPPTPRE(+)的EIAV載體質(zhì)粒pcPPTWPRE。轉(zhuǎn)染實驗表明，在體外傳代細胞系HEK293中，WPRE可以顯著提高EIAV基因轉(zhuǎn)移載體的外源蛋白表達能力；而在DF-1細胞中，載體pcPPTWPRE表達外源蛋白的能力略高于pcPPTPRE(+)，雖然兩者的表達量均不高。 2．利用雜合啟動子人巨細胞病毒立即早期增強子/雞β-肌動蛋白啟動子(CAG啟動子)構(gòu)建EIAV基因轉(zhuǎn)移載體。PCR擴增CAG核心啟動子(不含雞β-肌動蛋

4、白第一內(nèi)含子)，將其替換EIAV載體質(zhì)粒pcPPTWPRE中的內(nèi)部啟動子人巨細胞病毒立即早期增強子/啟動子(CMVIE啟動子)構(gòu)建了EIAV載體質(zhì)粒pcPPTEIACAGp。體外轉(zhuǎn)染實驗表明,CAG核心啟動子在雞體外培養(yǎng)細胞DF-1中啟動外源基因表達的能力明顯高于CMVIE啟動子；而在HEK293細胞中，兩者啟動外源基因表達的能力相當。 3．在CAG啟動子的基礎(chǔ)上，利用酶切的方式分別構(gòu)建了含部分雞β-肌動蛋白第一內(nèi)含子的EIAV

5、載體質(zhì)粒pWCAGP0.8和含全長內(nèi)含子的EIAV載體質(zhì)粒pWCAGP1.6，研究雞β-肌動蛋白第一內(nèi)含子對EIAV基因轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒外源蛋白表達能力的影響。體外轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果表明，不含內(nèi)含子的EIAV載體質(zhì)粒pcPPTEIACAGp表達外源蛋白的能力優(yōu)于含部分或全長內(nèi)含子的載體pWCAGP0.8和pWCAGP1.6，雞β-肌動蛋白第一內(nèi)含子并沒有提高EIAV載體質(zhì)粒的外源蛋白表達能力，反而降低了其表達水平。 4．PCR．擴增rev

6、反應(yīng)元件RRE序列和EIAV 5′端R-U5序列，將其依次亞克隆入EIAV蛋白表達載體pCDGP中，借此研究RRE序列和5′端R-U5區(qū)對EIAV結(jié)構(gòu)蛋白表達的影響。體外表達實驗表明，EIAV-DLA基因組5、端的R區(qū)和U5區(qū)對EIAV結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄起決定性作用；Rev蛋白及其反應(yīng)元件RRE序列對gag/pol蛋白表達載體的表達是必不可少的。改造之后的gag/pol表達載體pSRU5GPR與rev表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293，IFA檢測獲