馬傳染性貧血病毒分離株WH17全基因組克隆、序列分析及LTR啟動(dòng)子活性研究.pdf

1、馬傳染性貧血病毒（Equine infectious anemia virus，EIAV）是反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬成員之一，可以引起馬屬動(dòng)物的一種急性烈性傳染病，以貧血、持續(xù)感染、反復(fù)發(fā)熱為特征，終生持續(xù)感染，是馬屬動(dòng)物最重要的傳染病之一。反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒基因組長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）對(duì)病毒復(fù)制有重要的調(diào)控作用，影響到病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞嗜性、致病力等方面。 本研究利用PCR方法分四個(gè)片段擴(kuò)增了從自然感染馬分離的馬傳染性貧血病毒

2、（簡(jiǎn)稱馬傳貧）的前病毒DNA，將PCR產(chǎn)物克隆于pMD18-T載體，得到四個(gè)重組質(zhì)粒P2.8、P2.4、P2.6、P1.2。經(jīng)PCR、酶切鑒定后進(jìn)行序列測(cè)定，分析、拼接得到馬傳染性貧血病毒野外分離株前病毒的全基因組序列，其基因組全長(zhǎng)8268bp。通過(guò)DNAStar分析，此分離株與馬傳貧病毒L株（L-EIAV）、馬傳貧驢強(qiáng)毒株（DA-EIAV）、馬傳貧驢白細(xì)胞弱毒疫苗株（DLA-EIAV）的序列同源性分別為86.0％、85.8％和85.2

3、％。 通過(guò)對(duì)EIAV分離株WHl7的LTR與L株、DA和DLA株的LTR序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其在在U3-R結(jié)合處多一個(gè)E-box基序，推測(cè)該基序的變化可能會(huì)起到促進(jìn)轉(zhuǎn)錄作用，為此將EIAV強(qiáng)毒株（DLA-25）、驢白細(xì)胞弱毒株（DLA-118）、EIAV分離株WH17以及U3-R結(jié)合處的E-box基序點(diǎn)突變的IXR分別克隆到pCAT3-basic質(zhì)粒中的報(bào)告基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）的上游，獲得一系列受不同LTR控制的CAT表

4、達(dá)質(zhì)粒。分別將含有不同來(lái)源LTR的CAT表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染驢胎皮膚細(xì)胞（FDD）、驢白細(xì)胞及接種EIAV弱毒的FDD及驢白細(xì)胞，結(jié)果顯示：在驢白細(xì)胞Tat蛋白可以特異性地增強(qiáng)EIAV-DLALTR的啟動(dòng)子活性，分離株WH17LTR的U3-R結(jié)合處的E-box基序?qū)at的反式激活作用并無(wú)明顯影響，而在驢胎皮膚細(xì)胞中，LTR啟動(dòng)活性也沒有檢測(cè)到。結(jié)果提示：EIAV分離株WH17的LTR U3-R結(jié)合處的E-box基序沒有起到促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的作用，LT