馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗致弱過程病毒基因的進化研究.pdf

1、20世紀70年代，哈爾濱獸醫(yī)研究所研制成功的馬傳染性貧血病毒（Equine Infectious Anemia Virus，EIAV）弱毒疫苗為控制馬傳染性貧血（Equine Infectious Anemia，EIA）在我國的流行做出了重要的貢獻。該研究成果榮獲1982年國家發(fā)明一等獎。該疫苗克服了慢病毒疫苗的開發(fā)難點，能在被免疫動物體內產生堅強的保護性免疫，是迄今為止唯一廣泛應用并證明確實有效的慢病毒疫苗。馬傳染性貧血弱毒疫苗的成功

2、，其中必定蘊藏著慢病毒致弱或誘導保護性免疫的機制，在HIV疫苗開發(fā)屢受挫折的背景下，系統闡明EIAV疫苗的減毒和保護機理，為HIV等慢病毒疫苗的研究提供參考。
　　EIAV弱毒疫苗是由自然野毒株經馬體、驢體和體外培養(yǎng)的驢外周血白細胞及驢胎皮膚細胞長期傳代培養(yǎng)而成。本文通過PCR和RT-PCR的方法分別擴增EIAV弱毒疫苗制備過程中不同代次病毒株的前病毒基因組序列、EIAV驢白細胞弱毒疫苗（EIAVDLV121）及其親本毒株EIAV

3、LN40感染馬匹后5個月內病毒S2/gp90序列，并進行序列分析比較。研究結果表明：（1）EIAV在體外傳代致弱過程中 LTR、env和S2等區(qū)域是主要的變異區(qū)域；隨著病毒在體外傳代培養(yǎng)次數的增加，各病毒株與親本毒株的遺傳距離逐漸增加；伴隨著病毒毒力的逐漸減弱，在基因組的各個區(qū)域出現了一系列穩(wěn)定變異位點，包括Gag的100A/T、103T/S和484D/N的替換；Pol的16K/E、598K/R和619N/D的替換；gp90的46A/E

4、、98G/R、103H/Y、189K/E、190E/K、193S/N、236D/-、237N/K、247E/K和321K/E的替換；Tat的7R/H的替換；S2的41T/I、51T/I和55Q/K的替換；Rev的74V/I的替換；LTR負調節(jié)區(qū)的細胞因子AP-1結合位點、增強子區(qū)E_box基序、R區(qū)的轉錄起始位點和TAR的起始位點的變異。（2）EIAVLN40在體內進化過程中病毒分為兩個大的分支，感染早期和無癥狀階段的病毒處在同一分支，

5、發(fā)病階段的病毒和EIAVLN40處在進化樹的另一分支；gp90的變異主要分布在8個變異區(qū)，V3、V4和V5區(qū)的糖基化位點的變化通常與發(fā)病狀態(tài)有關，EIAVLN40和多數發(fā)病后的序列在這三個區(qū)域都具有糖基化位點191NSSN194、237NNTW240和280NDTS283；病毒進化過程中，S2有12％以上的氨基酸出現穩(wěn)定的替換，這些變異的出現與疾病發(fā)展相關。（3）EIAVDLV121在體內進化過程中病毒gp90分成三個大的分支，各時間點

6、分離的病毒gp90與EIAVLN40的平均差異在0.91%-6.49%之間，與EIAVDLV121的差異在3.88%-6.73%之間；病毒S2基因進化過程中分為兩個分支，各時間點分離的病毒 S2與 EIAVLN40的平均差異在0.79%-8.83%之間，與EIAVDLV121的差異在.3.08%-8.14%之間。
　　研究證實：在 EIAV弱毒疫苗制備過程中，隨著病毒毒力減弱在基因組的各個區(qū)域都出現了一系列穩(wěn)定的變異；EIAVLN