人iPS細胞株的建立與ABCG2在人多能分化干細胞中缺失的意義探討.pdf

1、人胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)由于自身所具有的多向分化潛能和無限增殖的能力使它擁有廣闊的基礎及臨床應用前景。但是，人ES細胞建系過程中需要破壞受精卵或囊胚，因此，倫理問題成為ES細胞研究無法逾越的障礙；此外，從ES細胞中獲得的功能細胞對患者來說屬于異體細胞，細胞治療時的免疫排斥問題嚴重阻礙了它的臨床研究進展。在這種背景下，通過在分化的體細胞中表達特定的幾個轉錄因子，以誘導體細胞的重編程而獲得的可不斷自我更

2、新且具有多向分化潛能的誘導性多能干細胞(inducedpluripotent stem cell，iPSC)誕生了，由于它具有跟成體細胞完全相同的遺傳背景，又不涉及倫理道德問題，因此在應用潛能方面顯示出無比優(yōu)越性。但是，iPS細胞是否真正具備與ES細胞相同的分化能力和分化效率，是否能夠為將來的臨床移植提供具備相應功能的供體材料，近年來一直是干細胞領域中所被高度關注的焦點。
　　 干細胞中的旁系群體(side population

3、，SP)也一直是干細胞研究的熱點之一。對于眾多干/祖細胞而言，一個非常顯著的共性就是跨膜蛋白ATP綁定結構(ATP-Binding cassette，ABC)超家族成員之一，半轉運子ABCG2的表達。它們介導著包括細胞毒性藥物、類固醇、多肽、磷脂等在內的多類物質的轉運。ABCG2對熒光染料Hoechst33342的特異性排除，被認為是干細胞中SP分選的分子基礎，因此被用做這類細胞的特異性標記。然而ABCG2是否在人ES細胞和iPS細胞中

4、表達?干細胞SP分選的“黃金法則”是否也同樣適用于這些細胞呢?
　　 帶著這些問題，開始了我們的課題研究。整個課題是由三大研究部分所構成：第一部分-“人誘導多能干細胞(iPSCs)的建立”，第二部分-“人誘導多能干細胞(iPSCs)的多項分化和第三部分-“剖析在人胚胎干細胞(hESCs)和誘導多能分化干細胞(iPSCs)中膜轉運子ABCG2的表達與意義”。
　　 第一部分主要為iPS實驗技術平臺的建立。我們分別采用慢病毒

5、轉染系統(tǒng)和逆轉錄病毒轉染系統(tǒng)，將不同的轉錄因子組合(Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4或Oct4，Sox2，Nonog，c-Myc，Klf4和Lin28)導入人胎肺成纖維細胞(IMR-90)中，成功將其誘導成為具有完全相同遺傳背景的iPS細胞株。經相關檢測，發(fā)現(xiàn)這些iPS細胞均表達特異性多能分化標記，且能在小鼠體內形成包含三個胚層的畸胎瘤，提示它們具備跟ES細胞相似的多向分化潛能。
　　 第二部分主要為包括造血、神經以及滋

6、養(yǎng)層細胞在內的iPS細胞體外誘導分化。我們根據在人ES細胞的培養(yǎng)和分化的經驗，分別將我們所建立的iPS細胞系分化成造血細胞、神經上皮細胞、各類終末神經元以及滋養(yǎng)層細胞，并特別比較了人的ES細胞和iPS細胞的神經分化效率。結果表明，我們所得到的iPS細胞均具備向上述各類細胞分化的能力，而且經功能學檢測，發(fā)現(xiàn)將其誘導生成的運動神經元被激發(fā)后可產生與ES細胞來源運動神經元相似的動作電位，提示這類神經元是具備相關感觸和傳導功能的，有望用于將來的

7、臨床神經退行性病變的治療，但是不同iPS細胞系在神經分化的效率上存在著差異，其深層次的機制目前尚不可知。
　　 第三部分是一項發(fā)現(xiàn)導向型課題。我們在對人ES細胞及iPS細胞的研究過程中發(fā)現(xiàn)了一個非常奇特的現(xiàn)象，那就是區(qū)別于其他類型的干/祖細胞，人的ES細胞和iPS細胞胞核能夠被熒光染料hoechst所染色，通過進一步實驗證明這種現(xiàn)象是由于干細胞SP的分選標記-ABCG2在人ES細胞和iPS細胞中的缺失所導致的。并且恰恰相反，通過

8、常規(guī)方法hoechst染色對人ES細胞進行流式細胞術分選，得到拒染Hoechst的“SP”細胞實際上是多能分化基因已經下調的分化細胞，證明經典的干細胞“SP”的定義與分選并不適用于人的多能分化干細胞(ES細胞和iPS細胞)。而有趣的是，來源于人ES細胞的滋養(yǎng)層細胞和神經祖細胞卻能夠表達ABCG2因而可以拒染hoechst。與之相對，我們在小鼠的ES細胞中檢測到ABCG2的表達以及對Hoechst的拒染，而在小鼠的滋養(yǎng)層細胞中卻未發(fā)現(xiàn)其表

9、達。在人ES細胞中強行表達ABCG2則可以顯著增強它們對熒光染料hoechst和化療藥物米托蒽醌(mitoxanthrone，MTX)的抵抗性，并且大部分人ES細胞在撤去生長因bFGF(3天)后仍能維持其自我更新(self renew)狀態(tài)。我們在表達ABCG2的人ES細胞中還發(fā)現(xiàn)磷酸化的AKT表達水平顯著升高，提示ABCG2可能通過激活FGF信號通路的重要分支PI3K/AKT而降低人ES細胞對于子bFGF的依賴性，但是這其中的具體機制

10、還有待進一步探討。
　　 綜上所述，我們成功地通過不同的病毒轉染技術建立了iPS技術平臺，并進一步將所建立的iPS細胞系分化成造血干/祖細胞，神經上皮細胞和區(qū)域神經元，以及滋養(yǎng)層細胞，比較它們神經分化能力的差異并進行部分功能檢測，初步探討其做為不同細胞種類的移植候選物的可能性。同時我們首次系統(tǒng)性地闡述了干細胞SP分選標記ABCG2在人多能分化干細胞(ES細胞和iPS細胞)中的缺失，對于重新認識干細胞中的旁系群體、ABCG2與干細