白內(nèi)障患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)的建立及其定向分化的研究.pdf

1、年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract，ARC)為全球致盲眼病的主要原因。在我國(guó)約有250萬(wàn)人因白內(nèi)障致盲，占全球白內(nèi)障致盲總數(shù)的10％。隨著人口的老齡化，預(yù)計(jì)我國(guó)每年新增白內(nèi)障患者將超過(guò)100萬(wàn)，而我國(guó)的白內(nèi)障年手術(shù)量尚不足以解決每年的新增例數(shù)。因此，我國(guó)的白內(nèi)障盲防治問(wèn)題十分嚴(yán)峻。而先天性白內(nèi)障是指出生前即存在，或出生后才逐漸形成的先天遺傳或發(fā)育障礙的白內(nèi)障，超過(guò)1/3的患者是遺傳所致。任何參與、影響晶狀體發(fā)育的

2、基因突變都可能導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的發(fā)生。因此，明確先天性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制對(duì)于治療及預(yù)防先天性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。白內(nèi)障摘除聯(lián)合人工晶狀體(intraocular lens，IOL)植入是目前治療白內(nèi)障最常用且效果較為理想的方法，而后囊膜混濁(posterior capsular opacification，PCO)是影響病人術(shù)后遠(yuǎn)期視力預(yù)后的最常見(jiàn)的并發(fā)癥，其術(shù)后5年的發(fā)生率高達(dá)30％左右。雖然可以利用激光或者手術(shù)切開(kāi)混濁的后

3、囊膜，但是卻增加了病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并會(huì)帶來(lái)新的并發(fā)癥。所以如何預(yù)防PCO的發(fā)生是眼科醫(yī)生和病人都比較關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題。
　　 體細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的研究成果被國(guó)際生命科學(xué)界譽(yù)為具有里程碑意義的創(chuàng)新之舉。多能干細(xì)胞能夠自我更新，能在體內(nèi)外分化成幾乎所有類(lèi)型的細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)等方面有巨大的應(yīng)用潛力，具有極高的理論研究?jī)r(jià)值。通常用來(lái)源于囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的

4、胚胎干細(xì)胞、通過(guò)核移植得到的胚胎干細(xì)胞以及在成體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入外源轉(zhuǎn)錄因子得到的iPSCs，進(jìn)行體細(xì)胞重編程研究。在短短數(shù)年的時(shí)間里，此項(xiàng)研究已經(jīng)在細(xì)胞重編程的機(jī)理研究、探索疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用等領(lǐng)域引發(fā)了很多突破性的進(jìn)展；而且這一非克隆干細(xì)胞技術(shù)的誕生，成功地避開(kāi)了長(zhǎng)期以來(lái)爭(zhēng)論不休的倫理問(wèn)題，極大地推動(dòng)該領(lǐng)域和相關(guān)科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。與胚胎干細(xì)胞研究相比，體細(xì)胞重編程技術(shù)可以為更多的患者提供特異性多能干細(xì)胞。因而，在醫(yī)學(xué)應(yīng)用方

5、面(例如器官培養(yǎng)和器官移植等)有廣闊的前景。
　　 患者特異性的多能干細(xì)胞的建立能夠?yàn)榧膊“l(fā)病機(jī)制的研究、治療藥物的篩選及細(xì)胞移植治療提供有力的工具。采用慢病毒載體將外源性轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入白內(nèi)障患者晶體上皮細(xì)胞，從而獲得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。白內(nèi)障患者來(lái)源的多能干細(xì)胞的建立，能夠?yàn)榫w發(fā)育、細(xì)胞分化、衰老提供便利的細(xì)胞模型，同時(shí)可為白內(nèi)障治療藥物的篩選及白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究提供有力的研究工具。
　　 第一部分原代人晶體上皮細(xì)胞的

6、體外培養(yǎng)
　　 目的:對(duì)正常人晶體、年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞及人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并觀察體外培養(yǎng)的晶體上皮細(xì)胞及皮膚成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性及組織學(xué)變化。
　　 方法:正常人晶體上皮細(xì)胞培養(yǎng)取材于角膜移植術(shù)后供體眼的晶狀體囊膜，年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞培養(yǎng)取材于白內(nèi)障超乳手術(shù)中撕除的晶體前囊膜。角膜移植術(shù)后供體眼的晶狀體沿赤道部后方約2mm環(huán)形剪開(kāi)后囊膜，小心取下完整的前囊膜和赤道部囊膜，剪成1mm×1m

7、m大小的組織塊，利用組織塊貼片法，進(jìn)行原代人晶狀體上皮細(xì)胞的培養(yǎng)。白內(nèi)障晶體前囊膜在超乳手術(shù)中完整取材、洗去粘彈劑之后剪成1mm×1mm大小的組織塊，利用組織塊貼片法進(jìn)行培養(yǎng)。使用0.25％胰酶溶液對(duì)融合后的細(xì)胞進(jìn)行消化傳代。取年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的皮膚組織，剪成1mm3大小的組織塊，過(guò)夜消化，離心收集細(xì)胞，經(jīng)多次傳代后，獲得較為純化的皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下對(duì)三種細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。采用CCK-8法連續(xù)7天測(cè)定三種細(xì)

8、胞的增殖速率，繪制生長(zhǎng)曲線并進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:正常人晶體囊膜組織塊貼壁48～72小時(shí)后可見(jiàn)人晶狀體上皮細(xì)胞從組織塊邊緣長(zhǎng)出，約10～15天達(dá)到融合。初期正常人晶體上皮細(xì)胞為多角形，胞體透亮，細(xì)胞邊界清晰。融合后的細(xì)胞具有上皮細(xì)胞的形態(tài)特征，為典型的六角形或多邊形。在體外細(xì)胞可傳五代，但第三代以后細(xì)胞表型向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。第三代以后正常人晶體上皮細(xì)胞胞體呈梭形或長(zhǎng)條形。第五代正常人晶體上皮細(xì)胞老化，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡樣

9、改變，最后崩解死亡。白內(nèi)障患者晶體上皮細(xì)胞形態(tài)與增殖能力與正常晶體上皮細(xì)胞相類(lèi)似，但部分白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞與正常人晶體上皮細(xì)胞形態(tài)差異較大，更接近成纖維細(xì)胞，且細(xì)胞在第一次傳代后即老化崩解。人皮膚成纖維細(xì)胞伸展呈梭形或多邊形，在經(jīng)過(guò)多次培養(yǎng)傳代后，可得到較為純化的成纖維細(xì)胞。CCK-8法繪制的生長(zhǎng)曲線表明人皮膚成纖維細(xì)胞具有最高的增殖速率，白內(nèi)障患者的晶體上皮細(xì)胞增殖最慢。
　　 結(jié)論:利用組織塊貼片法進(jìn)行人晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)，

10、操作簡(jiǎn)單，成功率高。第二代人晶狀體上皮細(xì)胞是進(jìn)行細(xì)胞學(xué)及相關(guān)研究比較理想的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。正常人晶體上皮細(xì)胞具有較好的生長(zhǎng)及增殖能力，而白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞增殖力差、細(xì)胞形態(tài)不佳。人皮膚成纖維細(xì)胞在消化離心后經(jīng)過(guò)多次傳代能夠獲得純化的成纖維細(xì)胞。人皮膚成纖維細(xì)胞增殖最快，正常人晶體上皮細(xì)胞增殖速率居中，白內(nèi)障患者晶體上皮細(xì)胞增殖速率最慢。
　　 第二部分白內(nèi)障患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的建立
　　 目的:分別構(gòu)建表達(dá)OCT-4、SOX

11、-2和KLF-4的慢病毒載體(Lentivirus)，并轉(zhuǎn)染年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者體外培養(yǎng)的晶體上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)建立患者來(lái)源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，與同一患者來(lái)源的皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)比，觀察限定因子對(duì)于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。
　　 方法:選擇3例診斷為年齡相關(guān)性白內(nèi)障的患者，取其晶體前囊膜及皮膚組織進(jìn)行體外培養(yǎng)。白內(nèi)障晶體前囊膜在超乳手術(shù)中完整取材、洗去粘彈劑之后剪成1mm×1mm大小的組織塊，利用組織塊貼片法進(jìn)行培養(yǎng)。使用0.25％

12、胰酶溶液對(duì)融合后的細(xì)胞進(jìn)行消化傳代。取上述3例年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的皮膚組織，剪成1mm3大小的組織塊，過(guò)夜消化，離心收集細(xì)胞，經(jīng)傳代后，獲得較為純化的皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。分別將含有OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒載體質(zhì)粒(plenti-hOCT4/plenti-hSOX2/plenti-hKLF4)同輔助質(zhì)粒(pCMV-gag-pol-PA/pCMV-VSVg)一起共感染293T細(xì)胞，重組包裝構(gòu)建慢病毒載體(分別為L(zhǎng)en

13、ti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4)。將構(gòu)建的三種慢病毒載體混合分別感染第2代的白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)5天后，與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)進(jìn)行共培養(yǎng)，直至出現(xiàn)iPSCs。采用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)染色比較白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)生成iPSCs的效率差異。同時(shí)培養(yǎng)人H9胚胎干

14、細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)進(jìn)行對(duì)照。
　　 結(jié)果:利用組織塊貼片法培養(yǎng)的白內(nèi)障患者晶體上皮細(xì)胞及消化法培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)與增殖能力較好，第2代細(xì)胞適用于進(jìn)行慢病毒感染。構(gòu)建的慢病毒載體Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞，并不影響細(xì)胞的狀態(tài)及增殖能力。在慢病毒載體轉(zhuǎn)染后第5天，將白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞分別與MEFs進(jìn)行共培養(yǎng)

15、，在轉(zhuǎn)染后第12天開(kāi)始出現(xiàn)與ESCs形態(tài)相似的細(xì)胞克隆。細(xì)胞克隆堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)染色陽(yáng)性，說(shuō)明已成功誘導(dǎo)出iPSCs。采用AKP染色各比較3例患者的白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)生成iPSCs的效率差異，在1×106的細(xì)胞接種密度下，白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞平均可生成27.7個(gè)AKP陽(yáng)性的細(xì)胞克隆，而人皮膚成纖維細(xì)胞平均僅生成15個(gè)細(xì)胞克隆。白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞誘導(dǎo)形成的iPSCs細(xì)胞克隆

16、與ESCs在細(xì)胞形態(tài)上具有相似性。
　　 結(jié)論:構(gòu)建的慢病毒載體Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效轉(zhuǎn)染白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞，并成功誘導(dǎo)出與ESCs形態(tài)相似、AKP染色陽(yáng)性的iPSCs，且白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞與人皮膚成纖維細(xì)胞相比具有更高的iPSCs誘導(dǎo)效率。
　　 第三部分白內(nèi)障患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的鑒定
　　 目的:對(duì)誘導(dǎo)建立的白內(nèi)障患者來(lái)源的誘導(dǎo)性多能干

17、細(xì)胞(iPSCs)進(jìn)行鑒定，檢測(cè)細(xì)胞的分子標(biāo)記及體內(nèi)外分化能力，評(píng)價(jià)其多能性。
　　 方法:對(duì)已成功誘導(dǎo)的白內(nèi)障患者來(lái)源的iPSCs進(jìn)行多能性鑒定：基因表達(dá)、免疫熒光染色分析、RT-PCR檢測(cè)、體外分化擬胚體、體內(nèi)分化畸胎瘤檢測(cè)。提取iPSCs、ESCs和白內(nèi)障患者晶體上皮細(xì)胞的總RNA采用HG-U133-2 array(Affymetrix)對(duì)三種細(xì)胞的全基因表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行對(duì)比。提取iPSCs、ESCs和白內(nèi)障患者晶體上

18、皮細(xì)胞的總RNA，RT-PCR檢測(cè)人ESCs標(biāo)志性基因(Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2、VIMENTIN)表達(dá)。采用細(xì)胞免疫組化熒光(immunohistochemistry，ICH)檢測(cè)人ESCs標(biāo)志性抗原(SSEA-3、SSEA-4、Nanog、TRA-60、TRA-81、OCT-4)的表達(dá)。將iPSCs懸浮培養(yǎng)觀察擬胚體(embryoid body，EB)形成，并在培養(yǎng)基中添加特殊成分(BMP4，F(xiàn)BS，retin

19、oic acid(RA))觀察EB的體外分化。將iPSCs接種至裸鼠皮下，觀察畸胎瘤形成及體內(nèi)分化情況。
　　 結(jié)果:基因表達(dá)譜的分析結(jié)果顯示，iPSCs與ESCs的基因表達(dá)譜極為相似，但與白內(nèi)障患者晶體上皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜有較大差異。我們選擇了1例56歲的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的iPSCs，并隨機(jī)選擇其中4個(gè)細(xì)胞克隆(分別命名為iPS1、iPS2、iPS3、iPS4)進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR檢測(cè)的結(jié)果顯示，iPS1與ESCs的ES

20、Cs標(biāo)志性基因Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2和VIMENTIN的表達(dá)最為相似，而其他3株克隆與ESCs存在一定的差異。對(duì)iPS1進(jìn)行ICH檢測(cè)顯示，人ESCs標(biāo)志性抗原(SSEA-3、SSEA-4、Nanog、TRA-60、TRA-81、OCT-4)在iPS1中明顯表達(dá)。體外分化擬胚體的結(jié)果顯示，EB的分化使得Nanog和OCT-4表達(dá)下調(diào)，培養(yǎng)基中分別添加BMP4、FBS、RA之后，外胚層標(biāo)志性基因NACM、TH和GF

21、AP/內(nèi)胚層標(biāo)志性基因amylase、SOX7和AFP/中胚層標(biāo)志性基因PECAM、desmin和SCL在EB中的表達(dá)均出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)表達(dá)。對(duì)EB細(xì)胞進(jìn)行ICH檢測(cè)結(jié)果顯示，EB細(xì)胞表達(dá)中胚層標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、外胚層標(biāo)志物β-微管蛋白(tubulin beta1，Tuj-1)和內(nèi)胚層標(biāo)志物甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)。體內(nèi)分化畸胎瘤的結(jié)果顯示，裸鼠

22、注射iPSCs1個(gè)月左右可在裸鼠注射部位見(jiàn)腫塊形成，2個(gè)月后摘除腫瘤進(jìn)行組織切片檢查，鏡下可見(jiàn)三個(gè)胚層的組織細(xì)胞。
　　 結(jié)論:研究誘導(dǎo)的iPSCs在基因表達(dá)譜、ICH、RT-PCR檢測(cè)、體內(nèi)外分化能力方面與ESCs極為相似，建立的iPSCs具有與ESCs相同的多向分化能力。
　　 第四部分白內(nèi)障患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向晶體前體細(xì)胞的分化誘導(dǎo)
　　 目的:探討利用誘導(dǎo)因子三步法將白內(nèi)障患者來(lái)源的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)為晶體

23、前體細(xì)胞的方法，評(píng)價(jià)分化細(xì)胞與晶體細(xì)胞的相似性。
　　 方法:對(duì)已成功誘導(dǎo)的白內(nèi)障患者晶體上皮細(xì)胞來(lái)源的iPSCs及ESCs進(jìn)行三步法的分化誘導(dǎo)：在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加(1)第0～5天100 ng/ml Noggin；(2)第5～15天100 ng/ml bFGF、20 ng/ml BMP4和20 ng/ml BMP7；(3)第15～30天100ng/ml FGF2和20 ng/ml Wnt-3a。每5天提取iPSCs和ESCs的R

24、NA，RT-PCR檢測(cè)晶體細(xì)胞分化標(biāo)志基因PAX6、SOX2、SIX3、CRYAB、CRYAA、BFSP1和MIP表達(dá)情況，并繪制變化曲線。采用ICH檢測(cè)分化過(guò)程中晶體細(xì)胞分化標(biāo)志PAX6、α-晶體蛋白和β-晶體蛋白的表達(dá)。提取iPSCs、ESCs和人晶體的總蛋白，Western-blot法檢測(cè)晶體細(xì)胞分化標(biāo)志PAX6、α-晶體蛋白和β-晶體蛋白的表達(dá)水平并進(jìn)行比較。取3例人晶狀體，分別為22歲、44歲和65歲，提取總蛋白，并提取白內(nèi)障

25、患者晶體上皮細(xì)胞來(lái)源的iPSCs、人皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源的iPSCs及ESCs的總蛋白，Western-blot法檢測(cè)間隙連接蛋白43(connexin43)和纖維連接蛋白(fibronectin)，以評(píng)價(jià)其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymaltransitions，EMT)的程度。
　　 結(jié)果:經(jīng)過(guò)三階段誘導(dǎo)因子的作用后，對(duì)發(fā)生分化的iPSCs和ESCs進(jìn)行的RT-PCR檢測(cè)顯示，PAX6、CRYAB、C

26、RYAA、BFSP1和MIP的表達(dá)持續(xù)上升，SOX2的表達(dá)持續(xù)下降，SIX3的表達(dá)則是先上升后下降。ICH檢測(cè)的結(jié)果顯示分化過(guò)程中，iPSCs出現(xiàn)了晶體細(xì)胞分化標(biāo)志PAX6、α-晶體蛋白和β-晶體蛋白的持續(xù)表達(dá)。Western-blot的結(jié)果顯示，iPSCs、ESCs和人晶體中均有PAX6、α-晶體蛋白和β-晶體蛋白的表達(dá)，但ESCs的蛋白表達(dá)水平相對(duì)較低。EMT評(píng)價(jià)的結(jié)果顯示，connexin43在22歲晶體中表達(dá)量最高，隨著年齡的增

27、加而明顯降低，fibronectin則隨著年齡的增加表達(dá)量逐漸增高；而在白內(nèi)障患者晶體上皮細(xì)胞來(lái)源、人皮膚成纖維細(xì)胞的iPSCs及ESCs誘導(dǎo)分化的細(xì)胞中，connexin43在白內(nèi)障患者來(lái)源的細(xì)胞中表達(dá)量最高，而fibronectin的表達(dá)相似。
　　 結(jié)論:三階段誘導(dǎo)因子的組合作用能夠成功誘導(dǎo)出晶體前體細(xì)胞，且誘導(dǎo)分化的細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)晶體細(xì)胞的標(biāo)志性基因及蛋白。白內(nèi)障患者晶體上皮細(xì)胞來(lái)源的iPSCs相比人皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源