表達(dá)ABCG2的胚腎細(xì)胞系HEK293-ABCG2的建立及其活性鑒定.pdf

1、腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥的先天性或獲得性耐受是腫瘤化療面臨的主要問題之一。目前已鑒別出某些耐藥基因及其產(chǎn)物，其中ABCG2是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)的ATP-結(jié)合盒(ABC)超家族成員，也稱為BCRP、MXR和ABCP，它是ABC結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體家族最新成員，與P-gp和MRP共為人ABC家族三個(gè)主要外排泵。為更好研究ABCG2，本試驗(yàn)構(gòu)建了ABCG2表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)染建立了HEK293/ABCG2多藥耐藥細(xì)胞系并在細(xì)胞水平研究其生物學(xué)功能。從乳腺癌細(xì)胞系M

2、CF-7/MX中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模版擴(kuò)增ABCG2基因，構(gòu)建有ABCG2因的表達(dá)載體；利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞。用RT-PCR、間接免疫熒光和Western-blotting檢測(cè)ABCG2基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HEK293/ABCG2中的表達(dá)；體外細(xì)胞毒試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞系HEK293/ABCG2對(duì)米托蒽醌等抗腫瘤藥的耐藥指數(shù)；利用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦分別檢測(cè)其對(duì)羅丹明123和阿霉素外排作

3、用。另外利用siRNA轉(zhuǎn)染HEK293/ABCG2細(xì)胞，研究在siRNA作用下ABCG2的表達(dá)及耐藥狀況。試驗(yàn)結(jié)果顯示ABCG2基因在細(xì)胞系HEK293/ABCG2中的mRNA和蛋白水平上表達(dá)均明顯升高；其對(duì)多種抗腫瘤藥物有耐受，尤其對(duì)米托蒽醌的耐藥指數(shù)達(dá)147.57倍；經(jīng)1.5、3、4.5和6小時(shí)外排，細(xì)胞內(nèi)羅丹明123濃度分別降低了42.25％、66.47％、69.01％和71.80％；激光共聚焦顯微鏡下觀察到細(xì)胞水平胞內(nèi)阿霉素濃度

4、降低。siRNA轉(zhuǎn)染HEK293/ABCG2細(xì)胞后96小時(shí)內(nèi)，ABCG2基因的mRNA和蛋白的表達(dá)隨siRNA作用時(shí)間而明顯降低，體外細(xì)胞毒試驗(yàn)也顯示siRNA轉(zhuǎn)染的HEK293/ABCG2細(xì)胞與對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，對(duì)米托蒽醌和阿霉素的敏感性分別增加了87.0倍和2.3倍。因而得到結(jié)論：我們利用轉(zhuǎn)染方法成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)ABCG2的胚腎細(xì)胞系HEK293/ABCG2，并顯示出對(duì)多種抗腫瘤藥物具有耐受性，為今后更好研究ABCG2